구강편평세포암종의 치료표적으로서 Cripto-1의 역할 및 기전에 관한 연구

Abstract

1. 목 적 구강편평세포암종(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)은 경부림프절 전이를 동반하고 침습성이 높은 악성 종양이며, 구강암의 가장 흔한 유형으로 알려져 있다. 구강편평세포암종을 위한 진보된 치료전략에도 불구하고, 구강편평세포암종을 가진 환자의 5년 생존율은 약 50%밖에 되지 않기 때문에 구강암의 진행을 조절할 수 있는 새로운 표적 분자를 찾을 필요가 있다. Cripto-1은 종양유전자로 알려져 있고, epidermal growth factor-Cripto-1/FRL-1/cryptic (EGF–CFC) family의 한 구성원이다. Cripto-1은 유방, 대장, 폐, 자궁경부, 위, 췌장 및 비인두를 포함한 다양한 장기의 암종에서 과발현되는 반면, 정상적인 성인 조직에서는 발현이 없거나 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 상피-간엽전환(epithelial-to-mesenchymal transition: EMT)은 생리학적으로 발생, 조직재생 및 상처치유에 관여하는 과정이다. 또한, 암의 발생과 진행 과정에서 EMT가 암세포의 이동과 침습을 증가시키는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 Cripto-1의 발현 억제를 통해 OSCC 세포주의 증식과 이동을 억제할 수 있는지 여부와 관련 분자기전을 확인하고 이를 통해 치료 타겟으로서의 가치를 평가하고자 하였다. 2. 방 법 Cripto-1이 높게 발현되는 세포주를 선별하기 위해 13개 OSCC 세포주의 Cripto-1 발현을 western blotting을 통해 확인하였고, Cripto-1의 발현을 억제하기 위해 50nM 농도의 anti-Cripto-1 small interfering RNA(siRNA)를 처리하였다. 억제된 Cripto-1의 발현을 western blotting을 통해 확인하였다. 세포의 증식을 확인하기 위한 WST-1 assay 및 세포 이동을 관찰하기 위한 Transwell migration assay를 수행하였다. 분자기전을 확인하기 위해 HSC-3 세포에서 Cripto-1 발현을 억제시킨 후 western blotting을 통해 하위 신호체계 분자들의 발현 변화를 관찰하였다. 각 실험은 세 번씩 반복하여 수행하였다.

3. 결 과 Cell proliferation assay 결과, HSC-3와 HSC-4 세포주 모두에서 Cripto-1 발현을 억제시킨 실험군의 세포 증식이 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 수준으로 감소하였다 (p < .001). Cell migration assay 결과, Cripto-1의 발현을 억제시킨 HSC-3와 HSC-4 세포주에서 48시간 및 72시간 후 세포 이동이 대조군 에 비해 통계학적으로 유의한 수준으로 감소하였다 (p < .001). Cripto-1 억제 시, 세포의 생존과 증식, 이동에 관여하는 신호전달 분자들을 확인한 결과, p-Src(Tyr416) 발현은 변화가 없는 반면 p-AKT(Ser473) 및 p-ERK1/2(Thr202 /Tyr204)의 활성은 현저히 감소되었다. Cripto-1 억제 시, EMT 관련 분자들의 발현 변화를 관찰한 결과, nuclear NF-κB, Slug, Twist 발현은 감소되었고, E-cadherin 발현 증가 및 Vimentin 발현 감소를 확인하였다. 또한, Cripto-1 억제 결과, MMP-2는 발현의 변화가 없는 반면, MMP-9의 발현은 현저히 감소 되었다.

4. 결 론 구강편평세포암종에서 Cripto-1은 AKT/MAPK 신호체계, EMT 신호체계, 그리고 MMP-9 발현을 통해 세포 증식과 이동을 조절하는 것으로 여겨진다. 따라서, Cripto-1을 억제 시, 이들 신호전달체계를 차단하여 구강암의 증식과 진행을 억제할 수 있을 것으로 생각되어진다. 결론적으로, Cripto-1 발현의 억제는 OSCC 환자를 위한 새로운 치료 전략이 될 수 있음을 시사한다.

Background/Aims: The most common type of oral cancer is known as oral squamous cell carcinoma (OSCC) which is a highly invasive malignant tumor with frequent cervical lymph node metastasis. Despite the advanced therapeutic strategies for OSCC, the 5-year survival rate of patients with OSCC is merely 50%. Therefore, it is necessary to find novel prognostic factors and treatment modalities to prevent OSCC progression. Cripto-1 or teratocarcinoma-derived growth factor-1 (TDGF-1) is a member of the epidermal growth factor–Cripto-1/FRL-1/Cryptic (EGF–CFC) family. Cripto-1 has been found to be overexpressed in several human cancers including breast, colon, lung, cervix, stomach, and pancreatic cancer. Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is process that is physiologically involved in development, tissue regeneration and wound healing. In Vitro and in vivo studies have shown that Cripto-1 plays important oncogenic roles during tumorigenesis and tumor progression by promoting cell proliferation, migration, invasion and tumor angiogenesis as well as induction of EMT. In OSCC, EMT is a critical event to enhance the migration and invasion of OSCC cells. Therefore, the aims of this study were to determine whether knockdown of Cripto-1 by siRNA could inhibit cell proliferation and migration in OSCC cell lines, and to identify the molecular mechanism of Cripto-1 to play an oncogenic role in OSCC.

Methods: Cripto-1 expression in 13 OSCC cell lines was evaluated by western blotting. In Vitro Cell proliferation and migration assays were performed using HSC-3 and HSC-4, which showed relatively high expression of Cripto-1. For Cripto-1 knockdown, cells were transfected with 50nM of siRNA. The inhibition of Cripto-1 expression was confirmed by western blotting. WST-1 assay was used to evaluate cell proliferation. Cell migration was assessed using a transwell assay. In order to investigate the molecular mechanism of Cripto-1, Cripto-1 expression was inhibited in HSC-3 cells and the following changes of downstreaming signaling were examined by western blotting.

Results: In the cell proliferation assay, transfection with anti-Cripto-1 siRNA (50nM) induced a statistically significant decrease in the proliferation of HSC-3 and HSC-4 (p < .001 , respectively). In the cell migration assay, after 48h and 72h incubation, there was a statistically significant decrease in migration of both cells transfected with the anti-Cripto-1 siRNA at every time point, respectively. (p < .001). After knockdown of Cripto-1, the activities of p-AKT (ser473) and p-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) were markedly decreased but the expression of p-Src was not changed. Expression of nucleus NF-κB, Slug, Twist which are related with EMT, was decreased. E-cadherin expression was increased, but vimentin expression was decreased. In addition, expression of MMP-2 was not changed but expression of MMP-9 was remarkably decreased.

Conclusion: Knockdown of Cripto-1 could significantly inhibit cell proliferation and migration of OSCC cells through the AKT/MAPK signaling pathway. In addition, Cripto-1 could regulate the cell migration of OSCC by modulating EMT-related molecules and MMP-9. Therefore, suppression of Cripto-1 may be a new therapeutic strategies for the patients with OSCC.