Application of Solid-State Nanopore for Protein-Protein Interaction Inhibitor Screening

Abstract

초고속 및 고효율 전기적 판독 특성을 갖는 나노포어 기술은 단일 분자 수준의 분해능으로 생체 분자의 생물-물리학적 특성을 분석하는 기술로 발전하고 있다. 지난 10 년 동안 solid-state nanopore에 대한 연구는 DNA의 transport phenomena에 집중되어 왔는데, 그 중에서도 특히 DNA의 염기서열 분석에 초점을 맞추었다. 서로 다른 핵산 간의 물리적 크기 차이를 나노포어 신호의 차이로 구별하고자 하였으나, 나노포어의 공간, 시간 분해능의 부족 및 전기적 노이즈의 발생으로 인해 어려움을 겪고 있다. 최근에는 DNA가 아닌 단백질에 대한 나노포어 분석이 대두되고 있다. 단백질은 DNA와는 다르게 3차원 구조를 가지고 있고, DNA의 핵산보다 상대적으로 물리적 크기가 크기 때문에 비교적 낮은 공간, 시간분해능과 노이즈를 포함한 소자에서도 분석이 가능하다. 단백질은 다른 분자와의 결합을 통해 생체기능을 수행하는 생체분자로서, 단분자 단백질 신호를 측정하는 것은 생명현상의 기초 원리를 밝혀줄 중요한 단서를 제공해준다. 나노포어는 단분자 생체물질의 통과신호로부터 전기적 판독 특성을 가지기 때문에, 최근에는 단백질의 분석에 solid-state nanopore가 활용되고있다. 본 dissertation에서는 i) 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs)과 저분자 약물에 의한 억제, ii) PPI의 억제에 의해 유도 된 구조 변화, iii) 단백질 구조변화 기반 나노포어 적정을 통한 결합평형상수 측정에 대한 내용을 다루었다.

첫번째로, solid-state nanopore를 사용하여 항암 표적 단백질인 p53 transactivation 도메인 (p53TAD)와 mouse double minute 2 (MDM2) 사이의 상호 작용을 모니터링했습니다. 또한 이 상호작용의 Nutlin-3에 의한 억제를 나노포어 신호의 빈도로서 측정했다. MDM2 (isoelectric point; pI = 9.0)는 수용액 속에서 양전하를 띄고있고 전극에 음전압에 발생한 전기장에 의해 전기영동력에 의해 나노포어를 통과하게 된다. 그러나 음전하를 띈 p53TAD (pI = 3.6)와의 상호 작용의 결과로 MDM2의 전하가 음으로 변경되어 MDM2의 나노포어 통과신호의 빈도가 크게 감소한 것을 확인했다. 이 단계에서, p53TAD / MDM2 복합체에 Nutlin-3를 첨가하면 p53TAD / MDM2의 상호 작용이 억제되어 MDM2가 복합체에서 분리된다. 이 경우, MDM2와 복합체에서 분리되어 나온 MDM2 모두의 통과신호가 발생하기 때문에 나노포어 통과신호의 회복을 관찰할 수 있었다. 그러나, 이 접근법은 MDM2의 전하의 변화가 반드시 수반되어야 하는 시스템이기 때문에 단백질 시스템의 선정에 한계가 있다.

두번째로, 기존 나노포어 신호 빈도를 모니터링 하는 기존 방법을 보완하고자, 고체 상태 나노 기공을 사용하여 p53TAD-MDM2 융합 단백질의 약물에 의해 유도 되는 구조 변화를 모니터링하려고 시도했다. 단백질-단백질 상호 작용으로 인한 구조 변화를 효과적으로 감지하기 위해 p53TAD와 MDM2가 16 개 아미노산 linker로 연결된 융합 단백질 MLP (MDM2- linker -p53TAD)를 디자인 했다. MLP의 구형 형태는 single-peak (type I)을 보였으나 Nutlin-3에 의해 p53TAD와 MDM2 사이의 상호작용이 억제되어 linker가 풀어짐으로 인해 MLP는 덤벨 형태를 가지게 되고, 이에 의한 나노포어 통과신호는 double-peak signal (type II)로 나타났다. Nutlin-3 농도가 증가함에 따라 double-peak 대 single-peak 신호의 비율은 9.3 %에서 23.0 %로 증가는 것을 보였다. 또한 전압에 따라 type I과 type II 신호를 분석하여 서로 다른 구조를 가지는 단백질이 나노포어를 통과할 때 나타나는 동역학적 현상을 (translocation kinetics)이 분석했다. 또한 double-peak 신호 내부의 intra-peak의 크기를 분석하여 디자인한 단백질 복합체의 구조를 분석할 수 있었다.

마지막 part에서는, 약물 분자의 binding affinity를 정량적으로 평가하기 위해 세 가지 다른 small-molecule 약물 (Nutlin-3, NSC66811 및 SC204072)의 MLP에 대한 열역학적 평형상수를 측정했다. 측정 시스템에서 double-peak 신호를 구별하기 위해, 본 측정 시스템이 가지는 분해능의 한계를 분석해야한다. 이를 위해 p53TAD (residue 15-29)를 (GGGS)3GGS 로 대체하여, MLP 가 약물 없이도 dumbbell 형태를 지니는 복합체 (mutant MLP; mMLP)를 디자인했다. mMLP에서는 type I signal 대비 type II 신호의 최대 비율이 ~ 0.84로 나타났으며, 이는 본 측정 시스템에 대한 해상도의 한계를 의미하고 있다. 약물 분자에 의해 유도 된 MLP의 구조 변화로부터 type II fraction의 증가에 기반하여, 각 약물 분자에 의한 MLP 단백질에서 나타나는 type II fraction을 관찰 하였다. Type II fraction data에 결합 모델을 fitting하여 Nutlin-3, NSC66811 및 SC204072 각각에 대해 594 ± 39, 807 ± 12 및 2650 ± 177 nM의 Kd 값을 성공적으로 얻을 수 있었다. 위 결과는 isothermal titration calorimetry 실험 결과와 비교했을 때 유사한 값을 보여 주었으며, 나노포어가 가지는 단분자 측정, 극소량의 시료로도 측정이 가능하다는 점을 감안하면 기존 drug screening 기술의 한계점을 보완할 수 있는 장점을 가진 기술이라고 할 수 있다.

Owing to the sub-single-molecule resolution with ultra-fast, and high-throughput electrical reading characteristics, solid-state nanopores have attracted researchers for analyzing biophysical properties of biomolecules. Past decade, researches on solid-state nanopores have focused on the features of nucleic acids such as transport phenomena, and especially, sequencing of deoxyribonucleic acid (DNA) molecules. Recently, proteins are rapidly becoming the prime target for the solid-state nanopore research. In this dissertation, the recent achievements of protein molecule detection are discussed, which include: i) protein-protein interactions (PPIs) and its inhibition by small-molecule drug, ii) conformational change induced by inhibition of PPIs, and iii) development of drug screening platform using low-noise solid-state nanopores.

Firstly, we monitored the interaction between the p53 transactivation domain (p53TAD) and mouse double minute 2 (MDM2) as well as its inhibition by Nutlin-3 using solid-state nanopores. The positively charged MDM2 (isoelectric point; pI = 9.0) is driven through a nanopore by the applied negative potential. However, the net charge is altered to negative as a result of the interaction with negatively charged p53TAD (pI = 3.6), resulting that the capture frequency of MDM2 is significantly reduced at the negative electric potential. In this stage, the addition of Nutlin-3 into the p53TAD/MDM2 mixture inhibits the interaction of p53TAD/MDM2, thereby liberates MDM2 from the complex. We observed the restored event frequency of MDM2 in this case, reflecting the inhibition of the interaction between p53TAD and MDM2. However, this approach is only applicable to the protein system, where the change in net charge is employed.

Advanced from the monitoring event frequency, we attempted to monitor the drug-induced conformational changes of p53TAD-MDM2 fusion protein using solid-state nanopores. To effectively detect conformational changes resulting from the protein-protein interaction, we designed a fusion protein MLP (MDM2-linker-p53TAD), where p53TAD and MDM2 are connected by a 16 amino acid residue long linker. The globular conformation of MLP exhibited a single-peak translocation event (type I), whereas the dumbbell-like conformation of Nutlin-3-bound MLP showed a double-peak signal (type II). The proportion of double-peak to single-peak signals increased from 9.3 % to 23.0 % as Nutlin-3 concentration increased from 1-fold to 10-fold molar ratio to the MLP concentration. The translocation kinetics of the two different MLP conformations with varied applied voltage were analyzed. Further, the fractional current of the intra-peak of the double-peak signal was analyzed, probing the structure of our designed protein complex.

In the last part, we demonstrate solid-state nanopore titration of three different small-molecule drugs (Nutlin-3, NSC, and SC) into MLP to quantitatively evaluate the binding affinity of drug molecules. In order to reveal the resolution for discriminating double-peak signal in the measurement system, we introduced a modified MLP protein complex (mutant MLP; mMLP) by replacing p53TAD (residues 15-29; SN15) with an amino acid residue (GGGS)3GGS to form a dumbbell shape without any drug treatment. Since SN15 is exchanged with the amino acid repeat within mMLP, there is no binding motif toward MDM2, thereby exhibits all-dumbbell-shaped conformation in solution. The maximum type II event fraction revealed as ~0.84 for all-dumbbell shaped mMLP, implying resolution limitation for the measurement system. Based on the increase in type II fraction from conformational change of MLP induced by drug molecules, we observed different type II fraction for each drug molecule. By fitting the simple binding model to the type II fraction yields a dissociation constant (Kd) of the drug molecule, showing Kd as 594±39, 807±12, and 2650±177 nM for Nutlin-3, NSC, and SC, respectively. This approach of nanopore sensing may be extendedly employed in screening of PPI inhibitors and protein conformation studies.