Research on physiological effects of omega-3 and omega-6 fatty acid balance on animal inflammation and stress

Abstract

염증은 외부의 해로운 자극으로부터 숙주를 보호하는 필요한 생물학적 반응이지만, 만섬 염증은 개체의 부상과 세포의 죽음을 야기한다. 현대인들은 불균형한 식단이나 스트레스와 같은 만성염증을 유발하는 것들에 노출되어 있는데, 이는 당뇨병, 비만 그리고 암과 같은 질병의 증가와 밀접한 연관이 있다. 가축의 경우 역시 비슷한 환경이기 때문에, 이는 그들의 능력에 악영향을 줄 수 있다. 한편, 뉴트라수티컬은 질병을 예방하거나 치료하는 식품 성분을 뜻한다. 이는 기본적인 영양적 기능을 넘어 추가적인 치료적 혹은 생리적인 이익을 가져다 주기 때문에, 생리활성 물질을 규명하고 이를 정제한 형태로 제품을 개발하는 연구가 많이 진행되고 있다. 같은 맥락으로, 뉴트라수티컬의 사료첨가제로써 활용 역시 시도되고 있다. 많은 뉴트라수티컬의 경우 항염증 혹은 항산화 기능을 가지고 있기 때문에, 그들은 염증과 산화 스트레스를 감소시키는 데에 효과적일 수 있다. 특히나, 오메가-3 지방산은 염증 과정에 작용하는 대표적인 영양 성분인 다가불포화지방산이기 때문에 가축 건강 상태를 조절할 가능성이 있다. 또한 그 함량이 오메가-6 지방산에 비해 현대인과 가축의 식단 내에서 부족하기 때문에, 이 불균형은 숙주의 염증 항상성을 위협하여 많은 질병을 유발할 수 있다. 이외에도, Lactobacillus와 Bacillus와 같은 생균제는 항병원균 효과, 발효, 장관막 증진 그리고 면역조절 효과와 같은 기능을 가지고 있기 때문에 동물의 건강 상태를 증진시키기 위한 뉴트라수티컬로써 적용이 가능하다. 뉴트라수티컬의 건강 증진 효과를 평가하기 위해, 염증과 스트레스를 나타내는 생물학적 지표가 조사되어야 한다. 하지만, 많은 연구들은 오직 가축의 능력 변화에 대한 조사에만 집중하고 있었기 때문에, 뉴트라수티컬에 의한 생리학적 변화를 이해하는 데 있어서 불충분하다. 이번 연구에서는, 아마씨와 생균제를 뉴트라수티컬의 소재로써 선정하여 산란계의 염증, 스트레스 그리고 장내 균총을 포함한 다양한 생리적 변화를 조사하였다. 먼저, 아마씨가 산란계의 다가불포화지방산과 지질매개인자의 목록, 염증성 지표 그리고 스트레스 지표에 미치는 영향을 조사하였다. 다음으로, 아마씨와 2가지 생균제 (Lactobacillus plantarum, Lp; Bacillus licheniformis, T2)를 함께 사용하여 같은 항목에 대해 조사하였다. 더욱이, 밀식 스트레스가 산란계에 미치는 영향을 확인하여 아마씨와 2가지 생균제가 스트레스의 부정적 영향을 경감시킬 수 있는지 확인하였다. 첫 번째 연구에서는 알파-리포산의 생리적 효과를 in vitro와 in vivo에서 조사하였다. In vitro연구에서는 지질다당류로 자극한 쥐 대식세포주RAW264.7에 알파-리포산을 처리하였다. 종양괴사인자-alpha, 인터루킨-6, 인터루킨-1beta와 같은 전염증성 사이토카인 유전자의 발현이 줄어들었다. 또한, 고리형 산소화효소-2와 같은 지질매개인자 생성 효소의 유전자 발현 역시 감소하는 것을 확인하였다. In vivo 연구에서는, 알파리포산이 풍부한 물질인 아마씨의 상용화 제품인 Lintex 170을 33주령 산란계에 4주간 급여하였다. 아마씨를 급여함으로써, 달걀과 혈청에서의 오메가-6와 오메가-3의 비율이 모두 감소하였고, 이는 오메가-3 유래 지질매개 인자의 증가에 영향을 주었다. 이는 숙주의 염증과 스트레스 상태에 변화를 가져왔다. 두 번째 연구에서는, 아마씨와 생균제의 조합이 52 주령 산란계에 미치는 생리적 영향을 조사하였다. 생균제는 생산 수율과 목적 유전자 발현 유무를 기준으로 각각 3가지 Lactobacillus 균주와 2가지 Bacillus 균주로부터 Lp와 T2가 선정되었다. 아마씨와 생균제의 조합을 급여함으로써 생기는 특이적 변화들이 조사되었다. 아마씨의 효과는 오메가-6와 오메가-3의 비율의 감소, 간 내 전염증성 사이토카인 유전자의 발현이 감소와 같이 첫 번째 연구의 결과와 유사하였다. 한편, 아마씨와 Lp 조합의 특이적 효과로 계란 내 c9, t11-CLA 함량이 증가하였다. 또한, 염증과 스트레스 지표에 있어 부가적인 개선 효과가 있었고, 이는 산란 성적의 개선으로 이어졌다. 반면에, 아마씨와 T2 조합은 산란 성적에 있어 부정적인 영향을 확인하였다. 사양한 생균제의 종류에 따른 산란 성적의 차이는 장내 균총의 메타게놈 예측 결과와 연관지어 생각할 수 있다. 아마씨와 생균제 급여가 장내 균총에 유의적 변화를 가져왔기 때문에, 그들의 메타게놈 역시 실험군 별로 다르게 예측된 것들이 있었다. 예를 들어, 아마씨와 Lp를 급여한 실험군은 포스포엔올피루브산 당 인산기 전이체계의 활성화가 감소하는 것을 확인하였고, 이는 숙주의 영양소 이용가능성에 이익을 주어 산란 성적의 증가와 연관 지어질 수 있다. 아마씨와 T2를 급여한 실험군의 경우, 에너지 대사의 활성화가 예측되었는데, 이는 숙주의 에너지 이용성에 비효율을 초래하고 산란 성적을 감소시킬 수 있다. 세 번째 연구에서는, 아마씨와 생균제 조합이 밀식 상태의 52 주령 산란계에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해, 동일한 일반 사료를 급여하면서 밀식 스트레스가 산란계의 염증과 스트레스 상태 그리고 장내균총에 미치는 영향을 먼저 검사하였다. 이후, 같은 항목들을 이용하여 아마씨와 생균제가 밀식 상태의 52 주령 산란계에 미치는 영향을 조사하였다. 염증 지표, 스트레스 지표 그리고 산란 성적과 같은 전반적인 생리적 지표들이 밀식스트레스에 의해 악화되는 것을 확인하였고, 또 이것이 아마씨와 생균제에 의해 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 이들이 각각의 실험군에 대해 장내 균총과 그 예측된 메타게놈에 미치는 영향에 대해서도 확인하였다. 그룹 중에서, 아마씨와 T2를 급여한 실험군이 특이적으로 아미노산과 관련된 대사들을 활성화함을 확인하였고, 이는 산란 성적의 증가와 연관이 있을 수 있을 것이다. 이번 연구에서, 뉴트라수티컬 (아마씨와 생균제)과 밀식스트레스가 미치는 생리적 효과에 대해 조사하였다. 첫 번째 연구 결과를 바탕으로 했을 때, 아마씨의 급여는 오메가-6와 오메가-3의 비율의 변화와 지질 매개인자의 목록을 변경하여 산란계의 염증 및 스트레스 지표와 산란 성적에 영향을 준 것을 알 수 있었다. 이는 가축 식단 내 오메가-3 지방산 강화를 통한 균형된 불포화지방산 섭취가 스트레스 상황 등에서 숙주의 생리에 도움을 줄 수 있다고 결론지을 수 있다. 또한, Lactobacillus와 Bacillus와 같은 생균제는 c9, t11-CLA 생산이나 아미노산 관련 대사의 활성화 등을 통해 아마씨를 급여한 숙주의 항염증과 항스트레스 효과에 있어서 추가적인 효과를 줄 수 있다. 현재까지로는, 만성 염증과 스트레스가 실제적으로 가축의 생리에 영향을 끼치는지 명확히 하기 위해 더 많은 연구가 필요하다. 또한, 특정 사료첨가제가 염증과 스트레스 상태를 조절함으로써 숙주의 건강 유지에 도움을 줄 수 있는지를 증명하기 위한 반복실험이 진행되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 결과들은 혹독한 환경 내에 있는 가축의 복지가 영양적 관리를 통해 개선될 수 있음을 제안하며, 이는 동물 복지형 사료첨가제라는 신규한 사료첨가제의 범주에 대한 가능성을 보여준다.

Although inflammation is an essential biological process protecting the host from harmful stimuli, chronic inflammatory response causes injury and cell death. People today are exposed to many causes of chronic inflammation such as an unbalanced diet and stress, which are closely related to increased prevalence of diseases such as diabetes, obesity and cancer. Since livestock animals are also in a similar environment, their performance may also be adversely affected. In this context, nutraceuticals, which are food ingredients that can prevent or treat diseases, warrant attention. As they provide additive medical or physiological benefits beyond purely nutritional functions, numerous studies to identify bioactive materials and develop products in isolated form have been carried out. In the same context, the usage of nutraceuticals in livestock feed is also being attempted. Since many nutraceutical ingredients have anti-inflammatory or anti-oxidant properties, they can be effective in controlling inflammation and reducing oxidative stress. In particular, omega-3 fatty acids can potentially control livestock animal health state, as polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are representative nutrient components that influence the inflammatory process. Also, its content in todays diet for both people and livestock is lacking compared to omega-6 fatty acids, and this unbalance can threaten host inflammatory homeostasis, thereby provoking various diseases. Meanwhile, probiotics such as Lactobacillus and Bacillus can be applied as nutraceuticals to improve animal health because they have functions such as anti-pathogenic effects, fermentation, gut barrier reinforcement, and immunomodulatory effects. To evaluate the health promoting effects of nutraceuticals, biological markers indicating inflammation and stress should be monitored. However, many studies have focused only on investigating changes in the performance of livestock, and the physiological changes caused by nutraceuticals have not been adequately researched. In this study, flaxseed and probiotics were selected as nutraceuticals to investigate various physiological changes including inflammation, stress state, and gut microbiota in laying hens. First, the effects of flaxseed on laying hen PUFA, lipid mediator profile, inflammatory indices, and stress indices were investigated. Next, the effects of a combination of flaxseed and two probiotics (Lactobacillus plantarum, Lp; Bacillus licheniformis, T2) were investigated with regard to the same traits. Moreover, the effects of overcrowding stress on laying hen physiology also were evaluated to determine whether flaxseed and the aforementioned two probiotics can alleviate overcrowding stress effects. In study 1, the physiological effects of alpha-linolenic acid (ALA) were investigated in vitro and in vivo. In the in vitro study, ALA was treated in murine macrophage cell line RAW264.7 stimulated by a lipopolysaccharide. Several gene expressions of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-1beta (IL-1beta) were decreased. Also, gene expression of the lipid mediator-producing enzyme cyclooxygenase-2 was decreased by ALA treatment. In the in vivo study, the commercial flaxseed product Lintex 170, a representative material rich in ALA, was fed to 33-week-old laying hens for four weeks. With flaxseed feeding, the ratios of omega-6 to omega-3 in both egg and serum were decreased, which influenced omega-3 derived lipid mediator enrichment. This resulted in changes of the host inflammatory and stress state. In study 2, the physiological effects of the combination of flaxseed and probiotics on 52-week-old laying hens were investigated. Lp and T2 were selected as probiotic materials based on production yield and target gene identification among three Lactobacillus and two Bacillus species, respectively. Specific changes by flaxseed and probiotics were investigated. The effects of flaxseed were similar to those in study 1 in terms of lowering the ratio of omega-6 to omega-3 in eggs, decreasing pro-inflammatory indices such as gene expression of pro-inflammatory cytokines in liver samples. Meanwhile, the specific effects from a combination of flaxseed and Lp were increment of c9, t11-conjugated linoleic acid (c9, t11-CLA) content in egg samples. Also, there were some boosting effects on inflammatory indices and stress indices, which resulted in improved laying performance. On the other hand, the combination of flaxseed and T2 had some negative effects on laying performance. The difference in laying performance depending on the type of probiotics could be linked to the results of gut microbiota metagenome prediction. As there were some significant changes in gut microbiota of laying hens by flaxseed and probiotics, their metagenome also had different predicted parts depending on the group. For example, the group fed flaxseed and Lp was predicted to have lower phosphotransferase system activity than the other groups, which could be beneficial to host nutrient utilization and laying performance. In the case of the group fed flaxseed and T2, the group showed increased activity of energy metabolism compared to other groups, which could lead to inefficiency in energy utilization of the host and decreased laying performance. In study 3, the physiological effects of the combination of flaxseed and probiotics on overcrowded 52-week-old laying hens were investigated. To this end, the effects of overcrowding stress on the laying hen inflammatory and stress state and the effects on laying hen gut microbiota were first examined with a commercial basal diet. The effects of flaxseed and probiotics on overcrowded 52-week-old laying hens were then investigated for the same traits. The overall physiologic parameters such as inflammatory index, stress index, and laying performance traits were aggravated by overcrowding stress and confirmed to be recovered by feeding flaxseed and probiotics. Also, the effects of flaxseed and probiotics on gut microbiota of each group and their predicted metagenome were examined. Among the groups, the gut microbiota of the group fed flaxseed and T2 confirmed the activation of amino acid-related metabolism, which may be related to the improvement of laying performance. In this study, the physiological effects of nutraceuticals (flaxseed and probiotics) and overcrowding stress on laying hens were investigated. Based on results from study 1, it can be inferred that the lipid mediator profile as well as the ratio of omega-6 to omega-3 was altered by feeding flaxseed and this affects the inflammatory, stress indices, and laying performance of the laying hens. It could be concluded that a balanced intake of PUFAs by reinforcing omega-3 fatty acid in livestock diet might benefit the host physiology, especially under stress conditions. Moreover, probiotics such as Lactobacillus and Bacillus can have additive effects on anti-inflammatory and anti-stress effects to the host fed flaxseed via their byproducts such as c9, t11-CLA or amino acid metabolism-related activators. To date, more studies are needed to clarify the inflammatory or stress state of livestock animals in terms of whether chronic inflammation and stress actually affects their physiology. Also, repeated experiments should be conducted to demonstrate that some feed additives can help maintain the health of the host by controlling inflammation and stress conditions. Nevertheless, these results suggest that the welfare of livestock in harsh environments can be improved through nutritional management, which shows the possibility of a novel category of feed additive termed livestock welfare feed additives.