Studies on the Antimicrobial Activity and Mechanism of Hydroxyquinolines and Diketopiperazines from Marine Actinomycetes against Candida albicans

Abstract

해양의 독특한 환경(고압, 낮은 산소농도, 암흑상태)은 현재까지 밝혀지지 않은 다양한 종들의 생물들이 서식하고 있으며 이 다양한 생물종으로부터 구조적으로 특이성이 높으며 생리활성이 뛰어난 천연물들이 발견되고 있다. 특히 해양방선균의 경우 다른 생물종들과 달리 장기보관의 용이성, 유전자 조작으로 인한 천연물 생산성 향상이 가능한 점 및 대량배양이 가능한 점의 특징이 있기에 천연물 연구의 중요 자원으로 현재까지 활용되고 있다. 본 연구에서는 해양방선균 Streptomyces 균주로부터 hydroxyquinoline 계열의 물질과 diketopiperazine 계열의 대사산물을 분리 정제하였고 이들의 생리활성 측정 및 그 작용기전을 규명하였다. 첫번째 파트에서는 해양방선균인 Streptomyces sp. MBTG13의 쌀배지 배양액으로부터 hydroxyquinoline계열의 대사산물을 분리하였으며 이 물질의 Candida albicans의 균사 성장 저해 활성 및 작용기전을 규명하였다. C. albicans는 사람에게서 병원성을 띄는 대표적인 기회감염성 진균으로 다양한 환경 변화(혈장, 37 °C, 질소원 고갈, > pH 7.0)에 의하여 효모 및 균사형의 형태변환을 일으키는 특징을 지니고 있다. 특히 균사형의 형태변환 조절 기전은 인체 내 병원성 유발기전에 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져있다. 본 연구에서 분리 및 정제한 hydroxyquinoline은 항박테리아 성장 저해 활성을 지니고 있음을 확인하였다. 분리한 2-alkyl-4-hydroxyquinoline이 C. albicans의 quorum sensing 화합물인 farnesoic acid 및 farnesol 등과 구조적 유사성을 나타내기에 위 물질이 C. albicans의 형태변환 저해 활성을 나타낼 것이라 가정하였고 그 저해활성을 측정한 결과 C. albicans의 균사성장을 억제함을 확인하였다 (IC50 = 11.4 μg/mL). 균사성장 환경에서 C. albicans 형태 변환시 주요 신호 경로인 MAPK 경로 및 cAMP-PKA 경로 내 균사성장에 필수적인 유전자들을 대상으로 유전자 발현 분석을 통하여 2-alkyl-4-hydroxyquinoline이 cAMP-PKA 경로에 작용하는 것을 확인하였다. 두번째 파트에서는 해양방선균 Streptomyces puniceus로부터 diketopiperazine계열의 대사산물을 분리 및 정제하였으며 이 물질이 C. albicans내 항진균 표적분자인 isocitrate lyase (ICL) 를 저해함을 확인하였다. Glyoxylate cycle은 당류가 부족한 환경에서 미생물이 C2 탄소원을 이용하여 에너지 획득 및 TCA 회로의 중간물질을 공급하는데 있어서 매우 중요한 대사경로이다. ICL은 이 회로의 주요 구성 효소이며 인체 병원균의 병원성유발에 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다. 본 연구에서는 C. albicans 유래의 ICL 저해제를 찾고자 하였으며 그 결과 분리한 cyclo(L-Phe-L-Val)이 ICL 저해활성이 나타냄을 확인하였다 (IC50 = 27 μg/mL). Cyclo(L-Phe-L-Val) 처리시 ICL 유전자의 야생형과 결손 돌연변이의 성장 표현형 및 ICL 유전자 발현수준을 측정하였다. 그 결과 Cyclo(L-Phe-L-Val)은 ICL 유전자의 발현을 억제하는 작용기전을 통해 ICL 효소저해활성을 나타냄을 확인하였다. 본 학위기간동안 두 연구를 통하여 인간에 병원성 진균인 C. albicans의 병원성을 유발하는 균사성장 및 표적효소 중 하나인 ICL을 각각 저해하는 물질을 제시하였다.

The first part deals with the isolation and purification of 2-alkyl-4-hydroxyquinoline which possess inhibitory activity against yeast-to-hyphae transition derived from Streptomyces sp. MBTG13. Candida albicans, the opportunistic pathogenic fungus in humans, has an ability of reversible morphogenetic transitions between budding yeast and filamentous hyphal forms in response to environmental signals. Filamentous growth of cells is essential for pathogenicity of C. albicans. Four of 2-alkyl-4-hydroxyquinoline derivatives (1–4) were isolated from a semisolid rice culture of Streptomyces sp. MBTG13. Compound 1 is identified as an inhibitor of filamentous growth in Candida albicans, with an IC50 value of 11.4 μg/mL. Growth experiments show that this compound do not inhibit yeast cell growth, but inhibits hyphal growth inductions. Filamentous growth of C. albicans is mainly depended on activation of the mitogen-activated protein kinase or cyclic AMP-protein kinase A (cAMP-PKA) pathway. Based on the results of gene expression analyses, HWP1 and ALS3 (hypha-specific genes positively regulated by Efg1, an important regulator of cell wall dynamics), included cAMP-PKA pathway, are inhibited by compound 1 These results indicate that compound 1 acts on the Efg1-mediated cAMP-PKA pathway and regulates hyphal growth in Candida albicans. The second part deals with the isolation and purification of diketopiperazines which possess inhibitory activity against isocitrate lyase (ICL) enzyme from C. albicans. ICL, the key enzyme of glyoxylate cycle, plays an important role in the pathogenesis of microorganisms during infection. An icl-deletion mutant of Candida albicans exhibited reduced virulence in mice compared with the wild-type. Five of diketopiperazines (5-9) are isolated from Streptomyces puniceus Act1085. Compound 5 is identified as an C. albicans ICL inhibitor, with IC50 value of 27 μg/mL. Based on the growth phenotype of the icl-deletion mutants and ICL expression analyses, compound 5 inhibits the ICL gene transcription in C. albicans under C2-carbon-utilizing conditions.