MicroRNA-20 induces methylation of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in human hepatoma cells

Abstract

Background: Methylation suppresses transcriptional activity of hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA) in hepatocytes and this may contribute to its low replicative activity during the inactive stage of chronic HBV infection. However, the exact mechanisms of methylation are not known. It has been reported short hairpin RNAs induce methylation of the HBV genome in hepatoma cell lines, and that the microRNA (miR) 17-92 cluster negatively regulates HBV replication in human hepatoma cells. Moreover, miR-20a, a member of the miR 17-92 cluster, has sequence homology with the short hairpin RNA that induces HBV methylation. In this study, I tested the hypothesis that miR-20a functions as an endogenous effector of HBV DNA methylation. Method: HepAD38 cells, a cell line which permits HBV replication under the control of tetracycline-responsive promoter were used for in vitro HBV replication model. MicroRNA expression plasmids containing precursor sequences of the miR-17-92 cluster were transfected to HepAD38 cells. Methylation of HBV covalently closed circular DNA was assessed by methylation-specific PCR, and HBV relaxed circular DNA was quantified by real-time qPCR and Southern blotting. Quantification of cytoplasmic HBV pregenomic RNA was performed by real-time RT-PCR and dot blot analysis. After actinomycin D treatment, HBV pgRNA was measured to examine RNA stability by real-time RT-PCR. The association of Argonautes (AGOs) with HBV cccDNA was assessed by chromatin immunoprecipitation (ChIP). The presence of nuclear AGO-miR complex was assessed by ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP). Results: Over-expression of miR-20a suppressed the replicative activity of HBV and increased the degree of methylation of HBV cccDNA in the HepAD38 hepatoma cell line. AGO1 and AGO2, effectors of RNA-induced silencing complex, were found in the nucleus of HepAD38 cells. However, only AGO2 was bound to HBV cccDNA, and intranuclear AGO2 was loaded with miR-20a. Conclusion: MiR-20a is loaded onto AGO2, translocated into the nucleus, and induces methylation of hepatitis B virus DNA in human hepatoma cells, leading to suppression of HBV replication.

배 경: 메틸화는 간세포에서 B형간염 바이러스 (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA)의 전사 활성을 억제하며 이는 만성 HBV 감염의 비활성 단계 동안 낮은 복제 활성에 기여할 수 있다. 그러나 메틸화의 정확한 메커니즘은 아직 알려져 있지 않다. 우리는 사전 연구에서 short hairpin RNA가 간암 세포주에서 HBV 게놈의 메틸화를 유도한다는 것을 보여주었다. 우리는 또한 microRNA (miR) 17-92 cluster가 인간 간암 세포에서 HBV 복제를 억제한다는 것을 발견했다. 또한, miR-17-92의 구성원인 miR-20a는 HBV 메틸화를 유도하는 short hairpin RNA와 서열 상동성을 갖는다. 이 연구에서, 우리는 miR-20a가 HBV DNA 메틸화의 내인성 효과기로서 기능한다는 가설을 증명하였다. 그 결과, miR-20a의 과발현이 HBV의 복제 활성을 억제하고 HepAD38 간암 세포주에서 HBV cccDNA의 메틸화 정도를 증가시키는 것으로 나타났다. HepAD38 세포의 핵에서는 RNA 유도성 침묵 복합체의 효과기인 AGO1과 AGO2가 발견되었다. 그러나, AGO2만이 HBV cccDNA에 결합되었고, 핵 내 AGO2에는 miR-20a가 결합되었다. 실험방법: 테트라사이클린 반응성 프로모터의 조절하에 HBV를 복제하는 세포주인 HepAD38 세포를 HBV 복제 모델에 사용하였다. MiR-17-92 cluster의 전구체 서열을 포함하는 microRNA 발현 플라스미드를 HepAD38 세포에 형질 감염시켰다. 메틸화 특이적 PCR에 의해 HBV의 covalently closed circular DNA의 메틸화를 측정하였고, real-time qPCR 및 southern blotting으로 HBV relaxed circlar DNA를 정량하였다. 세포질 HBV pregenomic RNA의 정량은 real-time RT-PCR 및 dot blot 분석에 의해 수행되었다. Actinomycin D 처리 후 real-tie RT-PCR을 이용하여 HBV pgRNA를 측정하여 RNA의 안정성을 조사하였다. Argonautes (AGOs)와 HBV cccDNA의 연관성을 염색질 면역 침전 (ChIP)으로 평가하였다. 핵 AGO-miR 복합체의 존재는 ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP)에 의해 평가되었다. 결 과: MiR-20a의 과발현은 HBV의 복제 활성을 억제하고 HepAD38 간암 세포주에서 HBV cccDNA의 메틸화 정도를 증가시켰다. HepAD38 세포의 핵에서는 RNA 유도성 침묵 복합체의 효과기인 AGO1과 AGO2가 발견되었다. 그러나, AGO2만이 HBV cccDNA에 결합되었고, 핵 내 AGO2에는 miR-20a가 로딩되었다. 결론 : MiR-20a는 AGO2로 옮겨져 핵으로 옮겨지고 인간 간암 세포에서 B형간염 바이러스 DNA의 메틸화를 유도하여 HBV 복제를 억제합니다. 결 론: MiR-20a는 AGO2로 옮겨져 핵으로 옮겨지고 인간 간암 세포에서 B형간염 바이러스 DNA의 메틸화를 유도하여 HBV 복제를 억제한다.