OPTIMIZATION OF HANDLING CONDITIONS FOR THE EXOSOME AND APPLICATION TO THE NEURODEGENERATIVE DISEASES

Abstract

Exosomes are small extracellular vesicles with 30–100 nm diameter that originate from many type of cells. Exosomes serve as a role of intercellular messenger unit by inward budding and scission of vesicles from the limiting endosomal membranes and released from the MVB lumen into the extracellular environment during exocytosis. Secreted exosomes can be isolated and characterized in blood, urine, saliva in vivo and conditioned medium in vitro. They include various molecular constituents of their cell origin, including proteins, mRNA, and microRNA. Therefore, exosomes have been widely studied as a therapeutic agent, biomarker, and drug delivery vehicle. Despite of their importance in normal physiology and disease progression, the standard criteria of storage conditions, which are generally the pH and the temperature, are indefinite and controversial. Therefore, in this study, we isolated the exosomes after incubation in various pH conditions and analyzed the recovery yield of exosomes, and we examined the stability of exosomes at various storage temperatures. We have discovered that acidic condition was favorable for the high yield for exosome isolation, and the temperature below -70 °C is crucial for the preservation of exosomes in fresh condition for clinical and basic applications. After optimizing the isolation and storage conditions for the exosome, we examined that the human adipose stem cell derived exosome (ASC-exo) has a therapeutic potential for treating Alzheimers disease (AD), Huntingtons disease (HD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) by modulating representative cellular phenotypes. Adipose stem cells (ASCs) are regarded as the potential source of regenerative medicine, since ASCs express multiple factors for the paracrine effects and have a high proliferation rate with a lower senescence than other tissue-derived stem cells. Although exosomes derived from stem cells has therapeutic potential on many illnesses, precise mechanism of how ASC-exo affect the progression of HD, AD, and ALS has not been studied. We examined the effects of ASC-exo on key phenotypes of HD including cell death, and mitochondrial dysfunction in R6/2-derived neuronal cells, and mHtt aggregates levels. Also, we examined the effects of ASC-exo on key hallmarks of ALS including SOD1 aggregation, elevated SOD1 level and abnormal mitochondrial protein levels in G93A neuronal cells. Furthermore, we developed an in vitro AD model using neuronal stem cells (NSCs) from the transgenic mice line, TG2576. The differentiated NSCs of AD mice, which showed major phenotypes of AD including the Aβ pathology and increased apoptosis, were treated by ASC-exo. In addition, changes in neurite outgrowth were examined, as neurites are involved in the synapse formation of the central nervous system. We proved that ASC-exo ameliorate the progression of Aβ-induced neuronal death in AD, and ASC-exo modulates SOD-1 aggregation and mitochondrial dysfunction, making it a therapeutic candidate for ALS. In HD, we confirmed that the ASC-exo up-regulates PGC1, phospho-CREB and amelio rates abnormal apoptotic protein level, and reduces mHtt aggregates level. In addition, MitoSOX Red, JC-1 and cell viability assay showed that ASC-exo reduces mitochondrial dysfunction and cell apoptosis. These findings suggest that ASC-exo has a therapeutic potential for treating neurodegenerative diseases by modulating representative cellular phenotypes. Next focus is ameliroration of HD by heterochronic parabiosis (HP) which have been reported by a few paper in AD, presenting that exposure to a young blood circulation through HP reverses cognitive deficits observed with normal aging. To determine the effect of young circulatory factors on HD-like disease in R6/2 mice, we used HP, in which we joined the circulatory systems of young, wildtype animals together with R6/2 mice which express exon1 of the human HD gene with around 150CAG repeats. We analyzed the changes in protein expression in the brains of these mice with established disease after heterochronic parabiosis, and we examined the effects of young serum exosome on key phenotypes of HD including p-CREB-PGC-1 pathway, apoptotic proteins in R6/2-derived neuronal cells. mutant Huntingtin aggregation protein mice with established disease showed a restoration in levels of HD pathology. Moreover, young blood associated with improved mitochondria dysfunction and cognition, decreased cell death after exposure to young blood in heterochronic parabiosis. In addition, in vitro HD model cells treated with young blood serum and serum exosome showed decreased mHtt aggregation, mitochondrial dysfunction, cell death and cell proliferation. This study provides useful information for understanding the optimum conditions for the isolation and storage of exosomes, and by identifying the exosomes as a messenger unit that can transport the positive factors for the diseases, this study opens the possibilities for adopting the exosomes to various neurodegenerative diseases.

엑소좀은 직경이 30-100 nm인 작은 세포 외 소포이며 많은 종류의 세포에서 유래한다. 엑소좀은 endosomal membrane으로부터의 소포의 내부 발아 및 절단에 의해 세포 간 전달 단위의 역할을 하며, 세포외 배출 시 MVB 루멘에서 세포 외 환경으로 방출된다. 분비된 엑소좀은 체외에서 혈액, 소변, 생체 내 타액 및 조정 배지에서 분리되고 분석 될 수 있다. 여기에는 단백질, mRNA 및 마이크로 RNA를 비롯한 세포 기원의 다양한 분자 구성 요소가 포함된다. 따라서, 엑소좀은 치료제, 바이오 마커 및 약물 전달체로서 광범위하게 연구되어왔다. 정상 생리 및 질병의 진행에서의 중요성에도 불구하고, 일반적으로 exosome의 수득 및 저장 조건의 표준 기준은 불명확하고 논쟁의 여지가 있어 왔다. 따라서 본 연구에서는 다양한 pH 조건에서 엑소좀을 배양 한 후 분리하고 회수율을 분석하였으며, 다양한 저장 온도에서 엑소좀의 안정성을 조사하였다. 본 연구에서는 산성 조건이 엑소좀 분리에 대하여 높은 수율을 얻는 데에 유리하다는 것을 발견했으며, 임상 및 기본 분야 응용을 위하여 엑소좀을 신선하게 보존하기 위해서는 -20 ℃ 이하의 온도가 중요하다는 것을 발견하였다. 엑소좀에 대한 분리 및 저장 조건을 최적화 한 후 우리는 인간지방줄기세포에서 유래한 엑소좀이 (ASC-exo) 알츠하이머 병 (AD), 헌팅톤 병 (HD), 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 등의 질병의 대표적인 세포 표현형을 조절하는 것을 확인하였다. 지방 줄기 세포 (ASCs)는 재생 의학의 잠재적 원천으로 여겨지고 있는데, 지방 줄기 세포는 파라크린 효과에 대해 여러 인자를 내포하고 있으며, 다른 조직 유래 줄기 세포보다 낮은 노화로 높은 증식률을 나타낸다고 알려져 있다. 비록 줄기 세포에서 유래된 엑소좀은 많은 질병에서 치료적 잠재력을 가지고 있지만, ASC-exo가 HD, AD 및 ALS의 진행에 미치는 정확한 기전은 연구되지 않았다. 이에 본 연구에서는 R6/2 유래 신경 세포의 세포 사멸 및 미토콘드리아 기능 장애 및 mHtt 응집체 수준을 비롯한 주요 HD 표현형에 ASC-exo가 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 본 연구는 G93A 신경 세포에서 SOD1 집합체, 증가된 SOD1 수준 및 비정상적인 미토콘드리아 단백질 수준을 포함하는 ALS의 주요 특징에 대해 ASC-exo의 효과를 조사 하였다. 또한, AD 질병 모델에 대표적으로 알려진 트랜스 제닉 생쥐 라인인 TG2576에서 유래한 줄기 세포 (NSCs)를 사용하여 시험관내 AD 모델을 개발하였다. Aβ 병리 및 증가된 세포 사멸을 포함하는 AD의 주요 표현형을 나타내는 AD 마우스에서 분화된 NSC는 ASC-exo에 의해 질병이 개선됨을 확인하였다. 또한, 신경 돌기가 중추 신경계의 시냅스 형성에 관여하기 때문에, 신경 돌기 성장의 변화를 조사하였다. 이를 통해 ASC-exo가 AD에서 Aβ 유도성 신경 세포의 진행을 완화시키고 ASC-exo가 SOD-1 응집과 미토콘드리아 기능 장애를 조절하여 AD의 치료적 후보 물질이 될 수 있다는 것을 증명하였다. HD에서는 ASC-exo가 PGC1, phospho-CREB를 상향 조절하고 비정상적인 세포 사멸 단백질 수준을 개선하고 mHtt 응집체 수준을 감소 시킨다는 것을 확인하였다. 또한, MitoSOX Red, JC-1 및 세포 생존능 분석 결과, ASC-exo는 미토콘드리아 기능 장애 및 세포 사멸을 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 ASC-exo가 대표적인 세포 표현형을 조절함으로써 신경 퇴행성 질환을 치료할 수 있는 치료적 잠재력을 가지고 있음을 시사한다. 다음 주제는 Heterochronic parabiosis (HP)를 통한 젊은 혈액 순환을 통한 노출은 정상적인 노화로 관찰되는 인지 장애를 개선시킴을 확인한 결과입니다. R6 / 2 마우스의 HD 유사 질환에 대한 젊은 순환기 요인의 영향을 알아보기 위해 본 연구에서는 R6 / 2 마우스와 함께 젊은 야생형 동물의 순환계에 HP방법을 통하여 합류시켰다. Heterochronic parabiosis 후 질병이 확립된 R6 / 2 마우스의 뇌에서 단백질 발현의 변화를 분석하였고, p-CREB-PGC-1a 경로, 세포 사멸 단백질 및 세포 사멸을 포함한 HD의 주요 표현형에 젊은 혈장 exosome의 영향을 조사하였다. 그 결과, 헌팅톤 병의 대표적인 돌연변이형 헌팅틴 응집 단백질의 병리 수준이 회복됨을 확인하였고, 미토콘드리아 기능 장애가 개선되었으며, 인지 부분이 개선 됨을 확인할 수 있었다. 또한, 젊은 혈액에 노출된 후에 세포 사멸 감소를 확인하였다. 마지막으로 젊은 혈청 및 혈청 엑소좀으로 처리한 시험관 내 HD 모델 세포는 mHtt 응집, 미토콘드리아 기능 장애 회복 및 세포 증식을 확인하였으며, 세포 사멸을 감소 시킴을 확인하였다. 이를 통해 헌팅톤 병 개선을 시키는 물질이 젊은 혈장 내 exosome 내 물질일 가능성을 제시하였다. 이 연구는 엑소좀의 분리 및 저장을 위한 최적 조건을 이해하고 엑소좀을 질병 개선에 긍정적인 요소를 전달할 수 있는 메신저 단위로 확인함으로써 유용한 정보를 제공하고, 다양한 신경 퇴행성 질환에 대한 엑소좀을 치료제로 채택 할 수 있는 가능성을 열어준다.