Role of bacterial peptidoglycan in regulation of bone mass

Abstract

목적 최근 장내 미생물과 건강과의 상관관계가 주목을 받고 있으며, 특히 프로바이오틱스의 섭취가 장내 세균을 조절하여 노화에 따른 성호르몬 감소나 감염에 따른 골소실을 완화한다는 다양한 연구결과가 보고되고 있다. 하지만 장내 세균에 의한 골대사 조절이 세균의 어떤 구성성분에 의해 매개되는가에 대한 부분은 명확히 밝혀진 바가 없다. 기존 연구 결과에 따르면 장내 세균 유래의 펩티도글리칸이 혈류를 따라 이동하여 골수 내의 면역세포 활성을 조절할 수 있다고 보고된 바 있으며, 펩티도글리칸의 최소 활성단위인 muramyl ditptide가 nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) 2를 통하여 조골세포와 파골세포 분화를 직접 매개한다는 것이 제시된 바 있다. 따라서, 이 논문에서는 기존 연구결과를 바탕으로, 세균으로부터 유래하는 펩티도글리칸이 직접적으로 혈류를 따라 이동하여 조골세포와 파골세포의 분화를 조절할 수 있을 것이라는 가설을 설정하고 이를 증명하기 위한 연구를 수행하였다.

실험방법 세균의 펩티도글리칸이 골대사 조절에 관여하는지 확인하기 위하여 Lactobacillus spp.와 Bacillus spp.로부터 펩티도글리칸을 분리하였다. 펩티도글리칸의 분리는 세균균질기를 이용해 세균을 깨뜨린 후, sodium dodecyl sulphate, DNase, RNase, trypsin을 순차적으로 처리하여 지질단백질, DNA, RNA를 제거하였다. Trichloroacetic acid 처리로 펩티도글리칸을 침전시킨 후, acetone 처리로 다른 세포벽 구성 분자를 제거하고, 동결건조 후 중량을 측정하여 사용하였다. 수용성 펩티도글리칸은 mutanolysin 처리를 통해 준비하였다. NOD1 또는 NOD2의 신호전달 활성을 조사하기 위하여 NOD1 또는 NOD2가 과발현된 HEK 293 T 세포에 펩티도글리칸을 처리하고 nuclear factor-κB (NF-κB) 활성을 리포터 유전자 분석기법으로 확인하였다. 동물모델에서 L. plantarum으로부터 분리한 펩티도글리칸(Lp.PGN)의 효과를 확인하기 위하여 골소실 모델로 난소절제모델과 receptor activator of NF-κB ligad (RANKL)을 선정하고, 불용성 펩티도글리칸을 4주에 걸쳐 주 3회 위관 투여하였다. Lp.PGN의 직접적인 영향을 확인하기 위한 실험에서는 불용성 펩티도글리칸을 4주에 걸쳐 주 1회, 복강 또는 정맥투여하였다. 한편, B. cereus와 B. subtilis로 부터 분리한 펩티도글리칸을 4주에 걸쳐 주 3회 위관투여하여 마우스 대퇴골 내 소주골 변화를 미세단층촬영을 통해 분석하였다. 난소절제모델의 경우, 마우스 몸무게와 자궁 무게 측정, 혈청 내의 17-β estradiol 양 측정을 통해 난소 절제에 의한 성호르몬 감소가 유도되었음을 확인하였다. 골량 변화를 측정하기 위하여 마우스의 대퇴골과 요추골을 분리하여 미세단층촬영을 통해 대퇴골 내 소주골 또는 요추골 내 소주골을 분석하였다. 마우스 대퇴골은 탈회 후 조직절편을 얻어 조골세포 분화를 Runx2 면역형광염색법으로 확인하고, 파골세포의 분화를 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색법을 이용해 측정하였다. 한편, 펩티도글리칸 투여 시, 일정 간격으로 calcein을 투여한 후, 마우스 대퇴골 비탈회 조직절편을 얻어 신생골의 형성 정도를 분석하였다. 또한, 대퇴골의 골조직과 골수를 분리하여 조골세포와 파골세포 분화 관련 인자의 유전자 발현을 real-time RT-PCR을 통해 측정하였다. 펩티도글리칸 투여에 의한 골세포 분화관련 싸이토카인의 단백질 발현을 확인하기 위하여 펩티도글리칸을 투여한 마우스에서 serum과 bone marrow extracellular fluid를 얻어 TNF-α, interleukin (IL)-6, IL-1β, RANKL, P1NP, 또는 osteoprotegerin (OPG)의 발현을 enzyme-linked immunosorbent assay를 통해 확인하였다. In vitro 실험을 위한 조골세포 분화는 마우스 두개골에서 분리한 조골전구세포에 ascorbic acid와 β-glycerophosphate를 처리하여 유도하였으며, 파골세포 분화는 골수세포 유래의 대식세포에 macrophage colony-stimulating factor와 RANKL을 처리하여 유도하였다. 한편, 파골세포와 조골세포의 공배양 조건에서는 ascorbic acid, β-glycerophosphate, 1α,25-dihydroxyvitamin D3를 처리하여 배양하였다. 조골세포의 활성은 alizarin red S 염색법을 통해 확인하였으며, 파골세포 분화는 TRAP 염색법을 통해 세포를 염색하고, 핵을 세 개 이상 포함하는 다핵세포의 수를 측정하여 확인하였다. 각 세포의 분화와 활성에 관련된 인자의 유전자 발현 정도는 real-time RT-PCR로 관찰하였다.

결과 골소실 마우스 모델인 난소절제모델에 Lp.PGN을 투여하였을 때, 대퇴골과 요추골의 소주골 골량과 소주골의 수의 증가가 관찰되었다. Lp.PGN 투여는 난소절제로 인해 감소한 소주골 주변의 runt-related transcription factor 2 발현 증가를 유도한 반면, 난소절제로 인해 증가한 소주골 주변의 TRAP 발현을 억제하였다. RANKL로 유도한 골소실 모델에서의 Lp.PGN 위관투여 실험에서도 RANKL에 의해 감소된 대퇴골 내 소주골의 골량이 Lp.PGN 투여에 의해 증가하는 것을 확인하였다. Calcein 투여 실험을 통해 Lp.PGN 투여에 의한 골량 증가가 신생골 형성을 통해서 유도된다는 것을 확인할 수 있었다. In vitro 실험을 통해 Lp.PGN이 직접적으로 조골세포의 미네랄화 증가를 유도한다는 것을 확인하였으며, 파골세포와 조골세포의 공배양 조건에서 Lp.PGN이 조골세포가 발현하는 RANKL을 감소시켜 간접적으로 파골세포 분화를 억제함을 관찰하였다. Lp.PGN은 NOD2를 선택적으로 활성화하였으며, NOD2가 결손된 골다공증 모델 마우스에 Lp.PGN을 투여하였을 때, 야생형에서 나타난 골량 증가가 나타나지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 이 때, Runx2의 발현증가나 TRAP 발현 억제 또한 관찰되지 않았다. 뿐만 아니라, Lp.PGN의 직접적인 역할을 확인하고자 수행한 Lp.PGN의 복강투여나 정맥투여에서도 난소절제에 의해 감소한 대퇴골 내 소주골의 골량이 Lp.PGN에 의해 증가됨을 관찰할 수 있었다. 또한, Lp.PGN의 위관투여는 serum에서의 난소절제에 의해 증가한 TNF-α와 IL-6의 발현을 감소시켰으며, bone marrow extracellular fluid의 RANKL/OPG ratio를 감소시킴을 확인하였다. 한편, B. cereus 유래의 펩티도글리칸(Bc.PGN)과 B. subtilis유래의 펩티도글리칸(Bs.PGN)은 NOD1을 선택적으로 활성화하였으며, Bc.PGN을 주 3회, 4주동안 위관투여한 결과에서 Bc.PGN에 의해 대퇴골 내 소주골 골량이 감소하였다. 이 때, Bc.PGN 투여에 의해 소주골 주변의 TRAP 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 파골세포와 조골세포의 공배양 조건에서 Bc.PGN에 의한 파골세포 분화영향을 관찰하였을 때, Bc.PGN은 조골세포가 발현하는 RANKL을 증가시켜 파골세포의 분화를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, Bc.PGN이 파골세포에 직접적으로 영향을 줄 수 있는지 확인하였을 때, Bc.PGN이 파골세포에 직접적으로 파골세포에 작용하여 ERK 인산화를 통해 파골세포의 분화 증가를 유도함을 관찰하였다. Bc.PGN은 조골세포에 직접적으로 작용하여 조골세포의 분화를 억제하는 것을 확인하였다.

결론 이상의 연구결과를 통해 NOD2의 활성화를 유도하는 펩티도글리칸이 조골세포 분화 유도와 파골세포 분화 억제를 통해 골량을 증가시키고, 반대로 NOD1의 활성화를 유도하는 펩티도글리칸은 조골세포 분화 억제와 파골세포 분화 유도를 통해 골량을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 장내세균총 유래의 펩티도글리칸이 NOD1과 NOD2를 통해 골대사를 조절할 수 있을 것이라는 가능성을 제시하며, NOD2를 활성화하는 펩티도글리칸의 경우 골질환 치료 제어를 위한 타깃 물질로 작용할 수 있을 것으로 기대된다.

Objectives It has been suggested that gut microbiota, a bacterial community colonized in the intestine, interacts with host and influences on various physiological regulations including bone homeostasis. Peptidoglycans (PGNs) are the most abundant bacterial cell wall components and their fragments released from the gut micr5obiota can be delivered into the bone marrow and potentially affect the bone metabolism. Therefore, the objective of the present study is to elucidate the role of bacterial PGNs in the regulation of bone metabolism using in vivo and in vitro models. Under the research objective, (i) direct effect of PGN on osteoblast or osteoclast differentiation and (ii) indirect effect of PGN on host factors involved in the regulation of bone metabolism were investigated.

Methods Insoluble PGNs from various Lactobacillus spp. and Bacillus spp. were purified by sequential treatment with sodium dodecyl sulfate, DNase, RNase, trypsin, trichloroacetic acid, and acetone. Soluble PGNs were prepared by treatment of the purified PGNs with mutanolysin. Nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) 1 or NOD2 activation by PGNs was determined by reporter gene assay. Mice were intragastrically given phosphate buffered saline (PBS) or insoluble PGN by oral gavage technique three times weekly for four weeks. In a separate experiment, mice were intraperitoneally or intravenously given PBS or insoluble PGN once weekly for four weeks. Ovariectomy (OVX)-induced osteoporosis mouse model and receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced osteoporosis mouse model were prepared for in vivo studies. Estrogen deficiency was confirmed by measuring body weight, uterus weight, and level of 17β-estradiol in the serum. Bone morphometric parameters (trabecular bone volume, trabecular number, trabecular separation, and trabecular thickness) of femur and lumbar were analyzed by X-ray microcomputated tomography. Differentiation of osteoblast and osteoclast in vivo was determined by immunofluorescence staining of runt-related transcription factor 2 (Runx2) and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining, respectively. Calcein AM was intraperitoneally injected to the mice to observe new bone formation and the related parameters were measured by using OsteoMeasure software. The levels of RANKL, osteoprotegerin, and tumor necrosis factor (TNF)-α in bone marrow extracellular fluid or that of P1NP, TNF-α, interleukin (IL)-6, and IL-1β in serum were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The mRNA expressions of osteoclast or osteoblast differentiation markers were determined by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction. Osteoblast precursors were isolated from calvariae of one-day mice. Bone marrow-derived macrophages (BMMs) were prepared by incubation of bone marrow cells with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and committed osteoclast precursors were prepared by incubation of BMMs with M-CSF and RANKL. To observe direct effect of PGN, calvarial osteoblast precursors were stimulated with soluble PGNs in the presence of β-glycerophosphate and ascorbic acid. Osteoblast differentiation and function were determined by alkaline phosphatase staining and alizarin red S staining, respectively. BMMs or committed osteoclast precursors were stimulated with PGNs in the presence of M-CSF and/or RANKL. BMMs co-cultured with osteoblasts were stimulated with soluble PGNs in the presence of β-glycerophosphate, ascorbic acid, and 1α,25-dihydroxyvitamin D3.

Results Intragastric administration of insoluble L. plantarum PGN (Lp.PGN) increased trabecular bone volume and trabecular number in both femurs and lumbar vertebrae in OVX-induced osteoporosis mouse model. When the effect of PGNs from various Lactobacillus spp. on trabecular bone was further examined, insoluble PGNs isolated from L. casei, L. delbrueckii, L. rhamnosus GG, L. agilis, L. ruminis, and L. saerimneri increased femoral trabecular bone volume and trabecular number in OVX-induced osteoporosis mouse model. Runx2 immunofluorescence or TRAP straing of paraffin sections of femur showed increased Runx2-positive and decreased TRAP-positive areas on bone surfaces in OVX mice supplemented with Lp.PGN compared to the OVX control mice. In addition, calcein double labeling demonstrated that supplementation of Lp.PGN induced new bone formation. Intraperitoneal or intravenous administration of insoluble or soluble Lp.PGN increased femoral trabecular bone volume and trabecular number in OVX-induced osteoporosis mouse model. In addition, in vitro osteoblast differentiation assay demonstrated that soluble Lp.PGN directly induced osteoblast mineralization. On the other hand, soluble Lp.PGN attenuated osteoclast differentiation in BMM/osteoblast co-culture system. Reporter gene assay demonstrated that Lp.PGN preferentially activates NOD2, but not NOD1, and that soluble Lp.PGN more potently activates NOD2 signaling than insoluble Lp.PGN does. Intragastric administration of Lp.PGN in NOD2-deficient OVX mice did not exhibit trabecular bone mass changes, while that in wild-type OVX mice increased bone mass. Moreover, Runx2-positive areas were not increased and TRAP-positive areas were not decreased by supplementation with Lp.PGN in NOD2-deficient mice. Moreover, RANKL/OPG ratio was significantly decreased in bone marrow extracellular fluid and the levels of TNF-α and IL-6 were decreased in serum from OVX mice supplemented with Lp.PGN in comparison with that from OVX control mice. In contrast to the Lp.PGN, B. cereus PGN (Bc.PGN) and B. subtilis PGN (Bs.PGN) preferentially activated NOD1. Intragastric administration of Bc.PGN or Bs.PGN decreased trabecular bone volume and/or trabecular number. TRAP strained paraffin sections of femur showed increased TRAP-positive areas on bone surfaces. In addition, Bc.PGN increased osteoclast differentiation from BMMs co-cultured with osteoblasts. In vitro osteoclast differentiation demonstrated that Bc.PGN directly increases the number of TRAP-positive osteoclasts from committed osteoclast precursors. Bc.PGN induced phosphorylation of ERK and specific inhibition of ERK signaling attenuated Bc.PGN-induced osteoclast differentiation.

Conclusion The present study demonstrates that NOD2-activaing PGN inhibits bone loss in osteoporosis condition through increasing osteoblast differentiation and decreasing osteoclast differentiation, whereas NOD1-activating PGN induces bone destruction. These results suggest that gut microbiota-derived PGN fragments could be involved in the regulation of bone metabolism through NOD1 and NOD2 siganlings and that the NOD2 ligands could be used as postbiotics for treatment of bone diseases.