Prokineticin Receptor 1 Activation Ameliorates Insulin Resistance in Mouse Skeletal Muscle Cells

Abstract

Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is manifested by progressive metabolic impairments especially in skeletal muscle which becomes resistant to insulin. To date, little is known about the mechanisms that control glucose level and insulin resistance in skeletal muscle. Activation of Prokineticin receptor 1 (Prokr1) appears to improve the obese and the diabetic phenotypes by reducing fat mass, enhancing insulin delivery to target tissues and increasing survival rate against myocardial infarction. However, the peripheral effect of Prokr1 on skeletal muscle has not been studied yet. In this study, we investigated the possible role of Prokr1 in insulin resistance in skeletal muscle using murine myoblast cell line (C2C12) and primary mouse muscular satellite cells. We examined the expression levels of Prokr1 in C2C12 and satellite cells during myogenic differentiation, and found that Prokr1 was upregulated during myogenic differentiation especially at protein levels. Prokineticin 2 (Pk2), a natural ligand of Prokr1, induced intracellular calcium mobilization in dose-dependent manner, indicating that Prokr1 would be coupled with Gq protein. Analysis of microarray datasets has been performed to identify differentially expressed genes (DEGs) by Pk2 treatment in human Prokr1-transgenic HEK293T cell line. We have identified 578 DEGs, including 309 downregulated and 296 upregulated ones by Prokr1 activation. Functional enrichment of DEGs identified that the Prokr1 would activate PI3K/Akt signaling pathway and MAPK/Erk signaling pathway. In vitro experiments confirmed that Prokr1 significantly activated PI3K/Akt signaling pathway in myotubes derived from C2C12 and satellite cells, regardless of the absence or presence of insulin. Furthermore, Prokr1 activation induced to translocate Solute Carrier Family 2 Member 4 (Slc2a4/Glut4) into plasma membrane in myotubes derived from C2C12 and satellite cells. In palmitate-induced insulin-resistant myotubes, Prokr1 activation enhanced insulin-stimulated Akt phosphorylation as well as Glut4 translocation to the plasma membrane, resulted in 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) uptake as well. Prokr1-mediated insulin sensitivity was also improved in palmitate-induced insulin resistant myotube. In vivo analysis demonstrated that compared to lean mice, Prokr1 protein level was decreased in skeletal muscle and white adipose tissue of Diet-Induced Obese (DIO) mice, which implied that the level of Prokr1 expression would be relevant to metabolic disorders. Taken together, these results demonstrate that Prokr1 would be a crucial player in insulin resistance in skeletal muscle, and Prokr1 would be a potential target for treatment of insulin resistance in T2DM.

제 2형 당뇨병은 고혈당을 특징으로 하는 일련의 대사성 질환을 통칭한다. 오늘날까지, 고혈당을 조절하는 약물들의 메커니즘은 알려져 있지만, 인슐린 저항성과 합병증을 조절하는 메커니즘에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 프로키네티신 수용체1의 활성화는 백색 지방의 양을 줄이고, 조직에 혈관을 통한 인슐린 전달 작용을 강화시킨다. 또 심근 경색 생존율을 증가시킴으로써 비만 및 당뇨병 합병증인 심혈관계 질환을 개선시킨다. 그러나 프로키네티신 수용체1이 골격근에서 미치는 영향은 아직 연구가 되지 않았다. 본 연구에서는 근모 세포와 근 위성 세포를 이용하여 골격근에서 인슐린 저항성에 대한 프로키네티신 수용체1의 역할을 조사했다.

근모 세포와 근위성세포의 분화과정에서 프로키네티신 수용체1의 발현 정도를 조사하였고, 그 결과 근세포가 근관 세포로 분화될수록 단백질 수준의 프로키네티신 수용체1의 수준이 증가함을 확인했다. 프로키네티신 수용체1 과 발현 신장세포주를 통해 칼슘 이동 실험을 해본 결과, 프로키네티신 수용체1의 천연 단백질인 프로키네티신 2는 농도 의존적으로 세포 내 칼슘 이동을 유도하여 프로키네티신 수용체1이 Gq 단백질과 결합되는 것을 확인했다. 프로키네티신 수용체1 과발현 신장세포주에 프로키네티신 2 처리에 하여 발현된 유전자차이를 알아보기 위해 microarray datasets의 분석을 진행했다. 프로키네티신 수용체 1 활성화에 의해 총 578개의 발현된 유전자차이를 확인했으며, 309개의 하향 조절된 유전자와 296개의 유전자를 확인했다. 발현된 유전자 차이가 어떠한 생물학적 의미를 동정해본 결과, 프로키네티신 수용체 1이 PI3K/Akt 신호전달경로와 MAPK/Erk 신호전달경로를 활성화시킬 것이라는 가설을 세웠다. 세포실험에서 프로키네티신 수용체 1은 인슐린의 존재 여부에 관계없이 근모세포와 근위성세포에서 유래된 근관에서 PI3K/Akt 신호 전달 경로를 유의하게 활성화시켰다. 또한, 프로키네티신 수용체 1의 활성화는 근모세포와 근위성세포에서 유래된 근관에서 포도당 수용체 4의 전이를 증가시켰고, 그에 따라 포도당 흡수를 증가시켰다. 포화지방산에 의해 인슐린 저항성이 유도된 근관에서 프로키네티신 수용체 1의 활성은 PI3K/Akt 인산화를 회복시켰고, 포도당수용체 4의 세포막으로의 전이를 증가시켰으며, 포도당흡수를 정상수준까지 증가시켰다. 결과적으로 포화지방산에 의해 유도된 인슐린 저항성이 유도된 근관에서 프로키네티신 수용체 1에 의해 인슐린 민감도가 향상되었다. 동물실험에서, 프로키네티신 수용체 1의 단백질 골격근 조직과 백색지방 조직에서 정상 마우스에 대비하여 비만 마우스의 단백질 수준이 감소하는 것을 확인했다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 프로키네티신 수용체 1은 골격근에서 인슐린 저항성을 개선시켰고, 프로키네티신 수용체 1이 제2형 당뇨병에서 인슐린 저항성 치료적 표적이 될 수 있음을 시사한다.