TM4SF5-dependent cross-talks between hepatocytes and macrophages during liver fibrosis.

Abstract

만성적 간질환은 지방간, 간염 및 섬유화/경화 그리고 간암을 포함하며 만성적인 염증 환경이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 간 섬유화는 만성 간 손상에 의한 결과물로 비가역적인 간 세포의 손상과 염증반응으로 인한 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)의 축적에 의해 일어난다. 간 섬유화의 악화는 간경화와 간암으로 이어지며, 현재까지 간 섬유화의 정확한 진단 방법과 치료 약물에 대해서는 잘 알려진 바가 없다. 이전 연구에 따르면 간 섬유화가 진행된 마우스 간 조직과 인간 간 세포에서 Tetraspanin superfamily에 속하는 막 단백질인 Transmembrane 4L 6 superfamily 5(TM4SF5)의 유전자와 단백질의 발현이 증가되어 있는 것으로 알려진 바 있다. 따라서 이를 토대로 본 연구에서는 TM4SF5가 간 섬유화를 유발하는 과정에서 간 상피세포와 대식세포 사이의 상호작용 및 면역적 환경에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. SNU-449 세포와 마우스 간 조직의 RNA-Sequencing을 통해, TM4SF5의 발현이 증가하면 IL-6의 하위 유전자의 발현 또한 함께 증가하는 것을 알 수 있었다. 그리고 Open database를 통해서 TM4SF5와 CCL20과 CXCL10 양의 상관관계를 알 수 있었다. 이를 바탕으로 CCL20과 CXCL10이 TM4SF5 발현에 의해 조절됨을 알 수 있었다. 다음으로, CCL20과 CXCL10의 발현을 조절하는 IL-6를 간 상피세포에 처리하였다. 이때, TM4SF5가 발현되지 않는 세포에 비해 TM4SF5가 발현되는 세포에서 STAT3의 인산화가 증가되었을 뿐만 아니라 CCL20, CXCL10의 발현이 증가된다는 것을 확인하였다. IL-6의 수용체와 TM4SF5의 물리적인 결합을 위한 면역침강법을 통해 IL-6의 작용과 TM4SF5의 발현이 상관성 있음을 확인하였다. 이러한 조건에서 TM4SF5의 선택적 억제제인 TSAHC[4′-(p-toluenesulfonylamido)-4-hydroxychalcone]를 처리하였을 경우 간 세포 내 IL-6 수용체와 TM4SF5의 물리적 결합이 소실 되고, CCL20, CXCL10의 발현 역시 TSAHC의 농도에 의존적으로 감소함을 확인하였다. 한편, 대식세포는 주변 환경에 따라 M1(classical) 또는 M2(alternative)로 분극화된다. M1-대식세포와 M2-대식세포의 Conditioned Media(C.M.)을 얻은 뒤 간 상피세포에 처리해 CCL20, CXCL10의 발현을 측정하거나 IL-6 수용체의 항체를 함께 처리한 실험을 통해 M1-대식세포에서 IL-6가 분비됨을 알 수 있었다. 즉, IL-6는 M1-대식세포에서 분비되며, 간 상피세포의 TM4SF5가 IL-6의 신호전달에 관여해 간 상피세포에서 CCL20, CXCL10을 분비하는 것으로 파악되었다. 이때 TM4SF5가 발현되는 간 상피세포로부터 분비된 CCL20, CXCL10은 M2-대식세포로 분화가 유도되는 것을 더욱 촉진하는 것을 THP-1과 Bone-marrow derived macrophage의 M2 marker(Arg-1, Ppar-γ, CD206 등)가 증가한 것을 통해 알 수 있었다. M2-대식세포는 Hepatic stellate cell을 활성화 시켜 Col1α1을 생성하며, 간 상피세포를 자극해 Laminin γ2의 형성을 유도하였다. 세포 수준의 실험 결과를 동물 수준에서 확인하기 위해, CCl4 처리에 의해 간 섬유화가 유도된 마우스 모델을 구축하여 분석하였다. CCl4의 처리는 TM4SF5의 증가와 Plasma ALT, 간 무게/몸무게 비율의 증가를 일으켰으며, 이는 간 손상의 지표이다. 그러나 CCl4와 TSHAC를 함께 처리하면 Plasma ALT, 간 무게/몸무게 비율이 덜 증가 하거나 궁극적으로 간 손상이 덜 일어난 것을 확인하였다. 그리고 조직 염색과 mRNA level을 통해 α-SMA, Collagen1α1의 발현이 TSAHC를 함께 처리한 그룹에서 감소한 것을 확인하였다. 또한, 간의 Ccl20, Cxcl10의 발현이 감소되고 이로 인해 간으로 유입되는 대식세포가 감소한 것을 알 수 있었다. 한편, 간 상피세포의 TM4SF5와 M1-대식세포에 의존적으로 증가하는 Ccl20의 간 섬유화에서의 역할을 알기 위해 Ccl20 siRNA를 정맥주사하고 CCl4로 간 섬유화를 유도하였다. 그 결과, Ccl20 siRNA을 함께 처리한 그룹이 CCl4만 처리한 그룹에 비해 염증의 정도와 ECM의 생성, 대식세포의 유입이 감소한 것을 조직 염색과 mRNA level을 통해 확인하였다. 결과적으로, TM4SF5를 발현하는 상피세포로부터 Ccl20의 분비가 TM4SF5-의존적 섬유화에 중요함을 확인할 수 있었다. 따라서, 이 연구를 통해 간 섬유화 과정에서 TM4SF5 의존적인 CCL20, CXCL10의 발현, 그에 따른 대식세포 분극화의 중요성을 알 수 있었으며, 간 섬유화 과정에서 TM4SF5를 발현하는 간 상피세포와 대식 세포의 상호작용을 조절하여 간 섬유화를 치료할 수 있는 가능성을 제시하였다.

Chronic liver disease includes fatty liver, hepatitis, fibrosis/cirrhosis in which the inflammatory environment is known to play an important role. In particular, hepatic fibrosis is a consequence of chronic liver damage and is caused by the accumulation of extracellular matrix (ECM) following chronic damage of hepatocytes and thereafter inflammatory reactions. Exacerbation of liver fibrosis leads to cirrhosis and eventually cancer. Therefore, earlier diagnosis and cure of liver fibrosis would be clinically beneficial. The previous researches have shown that expression level of transmembrane 4 L6 superfamily 5 (TM4SF5) in hepatocytes, a membrane protein belonging to the tetraspanin superfamily, increased in fibrotic human and mouse liver tissues. However, the roles of the microenvironment of the TM4SF5-positive hepatocytes in the development of fibrosis has not been examined. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of TM4SF5 on the cross-talk between hepatocytes and macrophages as well as the immune environment which would be involved in the progression of liver fibrosis. RNA-Sequencing of SNU449 cells and mice liver tissues without or with TM4SF5 expression showed that the expression of certain cytokine/chemokine genes down-stream of IL-6 increased by the expression of TM4SF5. The open database also showed a positive correlation between TM4SF5 and CCL20/CXCL10, indicating that CCL20 and CXCL10 could be regulated by TM4SF5 expression. Thus, this study has been examined the roles of CCL20 and CXCL10 in the TM4SF5-dependent fibrosis in the liver. First, when IL-6, a representative pro-inflammatory cytokine, was treated to hepatocytes, the phosphorylation of STAT3 was increased in cells expressing TM4SF5 as compared to cells not expressing TM4SF5. Expression of CCL20 and CXCL10, as known as down-stream genes of IL-6, were upregulated by TM4SF5 expression. The physical binding of IL-6 receptor α with TM4SF5 was confirmed by co-immunoprecipitation, indicating that TM4SF5-positive hepatocytes could be affected by IL-6 signaling, presumably for CCL20 and CXCL10 expression. Under these conditions, treatment of TSAHC [4-(p-toluenesulfonylamido)-4-hydroxychalcone], a specific inhibitor of TM4SF5, disrupted the physical binding of IL-6 receptor α and TM4SF5 in hepatocytes. In addition, expression of CCL20 and CXCL10 were also gradually reduced by TSAHC treatment in a dose-dependent manner. Macrophages, on the other hand, are polarized into M1 or M2 depending on their surrounding microenvironment. When the conditioned-media (CM) from M1-macrophages or M2-macrophages differentiated from THP-1 monocytes was treated to hepatocytes without or with IL-6 receptor antibody, the expression of CCL20 and CXCL10 in hepatocytes increased via the presumable secretion of IL-6 in M1-macrophages. In other words, IL-6 was secreted from M1-macrophages, and TM4SF5 in hepatocytes were involved in the signaling to synthesize CCL20 and CXCL10 by macrophage IL-6. Furthermore, CCL20 and CXCL10 secreted from TM4SF5-positive hepatocytes promoted the polarization of M2-macrophage, which was confirmed by increases in M2 markers (Arg-1, Ppar-γ, and CD206) in THP-1 and bone-marrow derived macrophage. The CM from M2-macrophages then activated hepatic stellate cells to produce Col1α1 (collagen 1 chain α1) mRNA and stimulated hepatocytes to induce the expression of Lamc2 (laminin γ2), suggesting their roles in fibrosis development. To confirm these results using in vivo animal model, a hepatic fibrosis mouse model was induced by Intraperitoneal injection of CCl4. Injection of CCl4 resulted in an increase in TM4SF5, plasma ALT and liver weight to body weight ratio, which were signs of liver damage. However, the injection of CCl4 together with TSHAC resulted in reduction of plasma ALT and liver weight to body weight ratio. Immunohistochemistry (IHC) and qPCR analyses confirmed that the expression of α-SMA, collagen1 α1 were higher in the group injected with CCl4, which were declined by additional TSAHC treatment. In addition, it was found that the expression of CCL20 and CXCL10 in the CCl4-induced fibrotic livers were reduced by TSAHC treatment, and importantly the macrophages infiltration into the liver was also the case, too. Because the expression of CCL20 in hepatocytes depended on TM4SF5 expression and M1-macrophages, I wanted to know the significance of CCL20 in liver fibrosis. Ccl20 siRNA was intravenously injected during IP injections with CCl4. As a result, IHC and qPCR showed that the group treated with CCl4 and Ccl20 siRNA reduced degree of inflammation, accumulation of ECM, and infiltration of macrophages, although the group treated with CCl4 alone showed higher levels of them. Thus, secretion of CCL20 in hepatocytes depending on TM4SF5 expression can be important for TM4SF5-dependent fibrosis. Altogether, this study showed that the importance of TM4SF5-dependent expression of CCL20 and CXCL10 and the effect of M2 macrophage polarization in the process of liver fibrosis. It is reasonable that liver fibrosis can be alleviated by regulating the cross-talks of hepatocytes expressing TM4SF5 with macrophages.