Research for anticancer mechanism of Toxoplasma gondii GRA16 protein against hepatocellular carcinoma cells

Abstract

Dense granule protein 16 (GRA16) is a Toxoplasma gondii secreted protein that localizes to the parasitophorous vacuole (PV) membrane. According to the recent studies, GRA16 interacts with HAUSP, a deubiquitinase enzyme, and directly regulates p53 and MDM2 through deubiquitylation. The present study aimed to investigate the efficacy of GRA16 in anticancer treatment. Given that alterations in phosphatase and tensin homolog (PTEN) and p53 are vital in liver carcinogenesis, and considering that the abnormal p53 gene appears in hepatocellular carcinoma (HCC), I investigated whether the expression of GRA16 in genetically modified HCC cells (GRA16-p53-wild HepG2 and GRA16-p53-null Hep3B) regulates PTEN and p53. I established the above mentioned GRA16 cell lines using the retrovirus system and evaluated the detailed mechanism of PTEN regulation using these cells. According to the results, the cell proliferation, anti-apoptotic factors, p-AKT/AKT ratio, cell migration, and invasive activity decreased in GRA16-stable-HepG2 cells. Conversely, the apoptotic factors PTEN, p53, and apoptotic cells (%) increased in GRA16-stable-HepG2 cells. However, these trends were not observed in Hep3B cells. Furthermore, HAUSP-bound GRA16 preferentially increased the stabilization of p53 by the nuclear localization of PTEN, rather than by MDM2-dependent mechanisms. These molecular changes appear to correlate with the reduced tumor mass in GRA16-stable-HepG2 cell-xenograft nude mice. A central finding of this study is that GRA16 as a HAUSP inhibitor targets the nuclear localization of PTEN and induces the anticancer effect in a p53-dependent manner. The genetic absence of p53 lowers the endogenous PTEN level and does not induce the GRA16-related anticancer activity. Taken together, my results suggest that the action of GRA16 targets the nuclear localization of PTEN and exerts an anticancer effect in a p53-dependent manner. Therefore, the efficacy GRA16 could be newly highlighted in the HCC treatment in a p53-dependent manner.

GRA16 단백질은 톡소포자충 분비단백질로써 기생충 공포막에 위치한 단백질이다. 최근 연구에 따르면, GRA16은 P53과 MDM2의 탈유비퀴틴화를 통해 직접 조절하는 효소인 HAUSP와 상호 작용한다고 알려졌다. 본 연구에서는 항암 치료에서 HAUSP와의 작용을 통한 GRA16의 항암 작용을 연구하고자 하였다. 간암 세포에서 포스파타제 및 텐신 상동체(PTEN)와 p53의 유전자의 변형이 흔하게 발견되기 때문에, 간암세포인 중 야생형 p53 타입인 HepG2 세포주와 p53의 유전자가 소실된 Hep3B 세포주에서 레트로바이러스 시스템을 사용하여 상기 언급 된 GRA16 단백질을 발현하는 세포를 확립하였고, 확립된 세포를 사용하여 PTEN과 p53 조절의 상세한 메커니즘을 연구하였다. 본 연구에서 확립된 세포를 이용하여 생체 외(In vitro) 실험에서 세포증식, 세포주기, 세포사멸, 암세포의 전이 및 침습 관련 실험을 진행하였으며, 야생형 p53 타입인 HepG2-GRA16 세포에서 PTEN의 핵 내 국소화 및 p53의 안정화를 통한 암세포의 성장억제를 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 결과는 p53이 소실된 Hep3B-GRA16 세포주에는 관찰되지 않았다. 또한, 탈유비퀴틴 효소인 HAUSP와 GRA16의 작용은 일반적으로 알려진 HAUSP 억제를 통한 MDM2 메커니즘보다 PTEN의 핵 국소화에 의한 p53의 안정화가 일어남을 확인하였다. 이러한 유전자 변화를 통한 암 세포 억제 작용은 누드 마우스에서 암세포 이종이식을 통한 연구에서도 확인 할 수 있었다. HepG2-GRA16 세포주 에서는 GRA16을 발현하지 않는 HepG2 세포에 비해 종양 크기가 감소함을 확인 할 수 있었으나 Hep3B-GRA16 세포주 에서는 GRA16이 발현하지 않는 Hep3B 세포와 차이를 보이지 않았다. 이 연구의 중요한 발견은 HAUSP 억제제로써 GRA16이 PTEN의 핵 국소화를 유도하고 p53 의존적 방식으로 항암효과를 유도함을 확인 한 것이다. 종합적으로, GRA16은 p53 의존적 방식으로 간암세포에서의 치료를 새롭게 제시할 수 있음을 강조한다.