Bioreducible Polymers with Crosslinked Structure and Fluorinated Arginine-functionalization for Gene Delivery Systems

Abstract

Bioreducible polymers have been extensively used for gene delivery systems due to their selective degradability in reducing conditions. Although bioreducible polymers have been studied for decades, studies about their cellular behavior are scarce. In this dissertation, two kinds of bioreducible polymers for gene delivery were investigated to examine the effect of polymer structure on gene delivery mechanisms such as polyplex formation, transfection efficiency, cellular uptake pathways, and so on. One is crosslinked bioreducible polymer (polypropylenimine-cystamine bisacrylamide, PPI-CBA), the other is fluorinated arginine functionalized bioreducible polymers (heptafluorobutyrated arginine functionalized poly(cystamine bisacrylamide-diaminohexane), FR-PCH). In the first part, a study on the extraordinary bioreducible behavior of PPI-CBA is described. In this study, it was found that the extraordinary reductive behavior of crosslinked polymer in comparison with linear bioreducible polymer. PPI-CBAs were synthesized successfully by using Michael addition reaction; they could form positively charged and nano-sized polyplexes with pDNA. Interestingly, they still retarded pDNA in reducing conditions, which is unusual for bioreducible polymers. PPI-CBAs showed comparable efficiency to PEI25k in serum conditions, which means PPI-CBAs possessed good serum-compatibility. However, cytotoxicity of PPI-CBAs was significant and increased with concentration and crosslinking degree. Decreased intracellular glutathione (GSH) and increased reactive oxygen species (ROS) levels with an increase of the crosslinking degree suggest that GSH consumption due to re-crosslinking of degraded PPI-CBAs in cytosol might induce the increase of intracellular cytotoxic ROS. Therefore, unlike linear bioreducible polymers, crosslinked bioreducible polymer, PPI-CBAs show unique degradation and intracellular behaviors based on their crosslinked structures. In the second part, the experiments were set to examine the effect of arginine conjugation and fluorination to linear bioreducible polymers. FR-PCHs were synthesized for gene delivery systems. They could form positively charged and nano-sized polyplexes with pDNA. Interestingly, some of FR-PCH polyplexes retarded pDNA even in reducing conditions, probably due to the hydrophobic interaction of fluoroalkyl chains. FR-PCHs showed comparable transfection efficiency to PEI25k in serum-free conditions and superior efficiency to PEI25k even in serum-containing conditions, which means FR-PCHs possessed good serum-compatibility. Good serum tolerance was also confirmed by further experiments such as polyplex size measurement in 10% FBS (fetal bovine serum) and transfection assay in various concentrations of FBS. The polyplexes consist of FR-PCHs maintained their particle size in the presence of serum. Even at 50% of FBS, FR-PCH also showed the highest transfection efficiency. In terms of cellular uptake, fluorination enhanced membrane permeability of FR-PCHs. By using cellular uptake inhibitors, it was thought that FR-PCHs seem to use multiple pathways, but interestingly nocodazole tremendously prevented the uptake in all cell lines used. On the other hand, cytotoxicity of the polymers was significant and increased with concentration and modification degree probably due to enhanced membrane permeability of FR-PCHs. The interaction between membrane and fluoroalkyl chain would cause cell death by undermining the integrity of the cellular membranes. Nevertheless, from the results, it was confirmed that fluorination can confer not only serum-compatibility but also improved membrane permeability.

생체환원성 고분자는 환원성 환경에서 선택적으로 분해될 수 있는 특징을 갖고 있어서 유전자 전달체로 널리 이용되고 있다. 하지만 수십 년 동안의 연구에도 불구하고 생체환원성 고분자의 세포 거동을 연구한 논문은 많지 않다. 본 연구에서는 크게 두 종류의 생체환원성 고분자를 다루고 있다. 첫째는 PPI-CBA로 명명한 가교 구조를 지닌 것이며, 둘째로는 FR-PCH로 명명한, 불화탄소와 아르기닌으로 개질한 생체환원성 고분자다. 첫 번째 부분에서는 PPI-CBA의 특이한 분해 거동이 주된 내용이라 볼 수 있다. PPI-CBA는 마이클 첨가 반응 (Michael addition reaction)을 이용해 합성이 진행되었는데, 합성된 고분자는 양이온을 띠고 있는 폴리플렉스 (polyplex) 나노 입자를 이룰 수 있었다. 전기영동에서 흥미로운 결과를 얻을 수 있었는데, 환원성 환경임에도 불구하고 PPI-CBA가 여전히 pDNA를 붙잡고 있었다. 한편, PPI-CBA는 세럼이 있는 상태에서 진행된 실험에서 유전자 전달 효율이 PEI25k보다 뛰어난 모습을 보여줬는데, 이는 PPI-CBA가 세럼과의 상성이 좋음을 의미한다. 그러나 독성이 문제가 되었는데, 세포 내 글루타치온 (glutathione) 과 활성 산소 농도를 측정한 결과를 통해 PPI-CBA의 분해된 부분이 끊임없이 재결합을 하면서 글루타치온을 소모하기 때문에 세포 독성이 발생하는 것으로 추측할 수 있었다. 다시 말해, PPI-CBA는 선형 구조의 생체환원성 고분자와는 다르게 독특한 분해 거동 및 세포 내 거동을 보이는 것으로 볼 수 있었다. 두번째 부분에서는 아르기닌과 불화탄소로 개질한 생체환원성 고분자인 FR-PCH에 대해 다뤘다. 마찬가지로 양이온성을 띠는 폴리플렉스 나노 입자를 형성할 수 있었는데 불화 탄소 치환이 많이 된 일부 FR-PCH는 환원성 환경에서도 pDNA를 붙잡고 있는 것을 볼 수 있었다. 이런 현상은 소수성 상호작용을 할 수 있는 불화탄소가 원인이지 않나 추측할 수 있었다. FR-PCH는 세럼이 없는 조건에서도, 있는 조건에서도 PEI25k를 능가하는 유전자 전달 효율을 보였는데, 이는 FR-PCH가 다른 고분자보다 세럼에 영향을 덜 받는다는 걸 의미한다. 세럼에 대한 상성은 다양한 농도의 세럼을 포함한 배지에서 유전자 전달 효율을 확인하는 등의 일련의 실험으로 추가적으로 확인해 볼 수 있었다. 그러나 좋은 유전자 전달 효율에도 불구하고 상대적으로 높은 세포독성을 지니는 것을 알 수 있었다. LDH가 세포 밖으로 방출되는 양을 봤을 때, 세포 독성은 불화탄소 사슬이 세포막과 강하게 상호작용하는 과정에서 유도되는 것이 아닌가 추측할 수 있었다. 그럼에도 불구하고 다양한 추가 실험을 통해, 불화탄소를 고분자에 도입하는 것이 세럼 안정성 향상이나 막 친화성 같은 것을 획득할 수 있는 좋은 방법이란 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 또한, 본 연구에서는 불화탄소 사슬과 아르기닌을 갖고 있는 유전자 전달체가 어떻게 세포 내로 들어가는지 알아보기 위한 실험들도 진행되었는데, 합성한 고분자는 특정한 하나의 세포 진입 기작을 이용하는 것 같지는 않았으며 노코다졸에 크게 영향을 받는 것을 확인할 수 있었다.