Resistance Mechanism to Pemetrexed According to Genetic Characteristics of Lung Cancer Cell Lines

Abstract

서론: 페메트렉세드는 비소세포폐암의 치료에 매우 중요한 항암제이다. 이전에 일부 연구자들은 적혈구 미세 소관 관련 단백질 유사 4 (EML4)-역형성 림프종 키나제 (ALK) 재배열이 있는 비소세포폐암에서 페메트렉세드의 치료 효과가 더 우월하다는 결과를 보고한 바 있다. 이 연구의 목적은 비소세포폐암에서 페메트렉세드에 대한 내성을 획득하는 기전을 규명하고, 이를 극복하는 방법을 개발함으로써 향후 임상적인 유용성을 평가하고자 하는 것이다. 이 연구에서는 여러 가지 비소세포폐암 세포주를 이용하여, 각 세포주가 가지고 있는 다양한 유전적 특성에 따른 페메트렉세드의 민감도와 내성 획득 양상의 차이를 분석하였다. 연구방법: EML4-ALK variant 1 재배열이 있는 폐선암 세포인 NCI-H3122 세포주와 EML4-ALK variant 3 재배열이 있는 NCI-H2228 세포주, 그리고 EML4-ALK 재배열이 없는 비소세포폐암 세포주인 A549와 NCI-H460이 실험에 이용되었다. 각 세포주에 페메트렉세드를 처리한 후 세포의 생존 양상을 비교하고 세포 주기를 분석함으로써 페메트렉세드에 대한 각 세포주의 민감도와 반응 기전을 평가하였다. 또한 A549, NCI-H460 및 NCI-H3122 세포주를 페메트렉세드의 농도를 점차 증가시켜가면서 장기간 노출시켜 배양함으로써 각각의 페메트렉세드-내성 세포주를 확립하였다. 만들어진 내성 세포주와 부모 세포주에 페메트렉세드를 처리한 후 세포의 생장 곡선을 비교하여 내성 발생을 확인하였으며, 부모 세포주와 내성 세포주의 증식 능력을 비교하기 위해 콜로니 생성 능력을 평가하였다. 또한 페메트렉세드 내성 획득 후 세포 내의 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR), 사람 표피 성장인자 (human epidermal growth factor receptor, HER) 관련 신호전달체계를 비롯한 각종 요소의 발현 변화를 확인하기 위해, 내성 세포주와 부모 세포주에 대해 웨스턴 블롯, 수용체 티로신 키나제 단백질 어레이 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 시행하였다. 페메트렉세드 내성 획득에 관여하는 EGFR 및 사람 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 관련 신호전달체계의 활성화를 억제함으로써 페메트렉세드 내성을 극복할 수 있는지 확인하기 위해, 내성세포주에 게피티닙, 라파티닙, 아파티닙, 크리조티닙과 같은 EGFR-HER 및 ALK 연관 신호전달체계 억제제들과 다양한 세포독성 항암제를 처리한 후 세포 생장 곡선을 비교하였다. 또한 내성극복기전을 확인하기 위해 억제제 처리 후의 AKT, MEK, 저산소증-유도성 인자 1 알파 등 하위 신호전달요소들의 농도를 웨스턴 블롯을 이용하여 비교 분석하였다. 결과: EML4-ALK variant 1 재배열이 있는 NCI-H3122는 다른 세포들에 비해 페메트렉세드에 좀더 민감한 것으로 나타났다. 세포주기 분석에서 A549, NCI-H460, NCI-H2228 세포주는 페메트렉세드 처리 후 S 분획이 증가한 반면, NCI-H3122에서는 sub-G1 분획이 증가하였다. 추가 실험을 통해 NCI-H3122에서 페메트렉세드에 의한 세포 사멸이 다른 세포주에 비해 낮은 농도에서 좀더 빨리 일어나는 것을 확인하였다. 페메트렉세드의 농도를 점차적으로 높여가면서 A549, NCI-H460, 그리고 NCI-H3122에 15개월간 노출시킨 결과, 페메트렉세드 내성 세포주를 확립하였다. 페메트렉세드 내성 A549, NCI-H460, NCI-H3122 세포주는 모두 각각의 부모 세포주에 비해 콜로니 생성 능력이 떨어져 있었다. 수용체 티로신 키나제 관련 단백질의 발현 수준을 각 세포주에서 비교한 결과 페메트렉세드 내성 NCI-H3122 세포주는 부모 세포주에 비해 EGFR 및 HER2의 발현이 증가되어 있었다. 이 변화는 EGFR 리간드의 농도에 비의존적이었기 때문에, 세포 내의 유전자적 변화에 기인한 것으로 생각된다. 페메트렉세드 내성 A549, NCI-H460 세포주에서는 이러한 변화가 관찰되지 않았다. EGFR 관련 신호 전달 경로를 억제하는 광범위 HER 억제제인 아파티닙은 NCI-H3122 부모 세포에서는 별다른 효과가 없었으나, 페메트렉세드 내성 NCI-H3122 세포주에서는 세포 사멸을 촉진하는 효과가 뚜렷하게 나타났다. 아파티닙은 또한 페메트렉세드 내성 NCI-H3122 세포에서 EGFR 신호 전달 경로 내의 요소들 및 저산소증-유도성 인자 1 알파의 발현을 억제하였다. 이는 페메트렉세드 내성을 획득하는 과정에서 활성화된 EGFR-HER 신호전달체계를 아파티닙으로 억제하면 추가적인 치료 효과를 기대할 수 있음을 시사한다. 결론: 페메트렉세드는 EML4-ALK 재배열이 있는 NCI-H3122에서 조기에 세포사멸반응을 유도한다. NCI-H3122에서 페메트렉세드 내성을 획득하였을 때 EGFR-HER 관련 요소들의 발현이 증가한다는 것은, EML4-ALK 재배열이 있는 비소세포폐암에서 페메트렉세드에 의해 억제된 ALK-연관 신호전달체계를 대신하여 EGFR-HER에 의한 세포 생존 기전이 활성화되는 기전이 페메트렉세드 내성 획득에 기여할 가능성을 시사한다. 광범위 HER 억제제인 아파티닙을 페메트렉세드 내성 NCI-H3122에 사용하면, 대체적으로 활성화된 신호전달체계를 억제하여 세포 생존을 저해함으로써, 페메트렉세드 내성을 극복할 수 있다.

Introduction : Pemetrexed is an important therapeutic agent in the treatment of non-small cell lung cancer. Previous studies have shown that pemetrexed is more effective in cases of echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4) - anaplastic lymphoma kinase (ALK)-rearranged non-small cell lung cancer, though the mechanism remains unknown. The aim of this study was to elucidate the acquired resistance mechanisms of pemetrexed and to establish appropriate treatment strategies to overcome these resistance mechanisms. We compared the sensitivity and resistance patterns of pemetrexed in various lung cancer cell lines according to the genetic characteristics of the lung cancer. Materials and Methods : Non-small cell lung cancer cell lines A549, NCI-H460, NCI-H2228 harboring variant 3 type EML4-ALK rearrangement, and NCI-H3122 harboring variant 1 type EML4-ALK rearrangement were used in this experiment. Cell proliferation assay and cell cycle analysis were performed to compare the viability and the patterns of cell cycling of these cell lines after pemetrexed treatment. We established pemetrexed-resistant sublines in A549, NCI-H460, and NCI-H3122 cell lines through exposure to increasing concentrations of pemetrexed. Colony forming assay was used to compare the proliferation capacity of parental and pemetrexed-resistant cell lines. Western blot was performed to analyze the difference in protein expression between parental and pemetrexed-resistant cell lines. Receptor tyrosine kinase protein array and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) were performed to confirm the changes of receptor tyrosine kinase pathway-related protein expression including epidermal growth factor receptor (EGFR) and human epidermal growth factor receptor (HER) in the cells after acquisition of pemetrexed-resistance. Based on the mechanism of pemetrexed-resistance acquisition associated with EGFR and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), the cells were treated with various small molecular inhibitors of this signaling pathway such as gefitinib, lapatinib, afatinib, and crizotinib and several cytotoxic agents and their survival curves were compared to find a way to overcome this resistance. Results : EML4-ALK variant type 1-rearranged NCI-H3122 was found to be more sensitive to pemetrexed than the other cells. Cell cycle analysis after pemetrexed treatment showed that the fraction of the S phase was increased in A549, NCI-H460 and NCI-H2228, whereas the portion of apoptotic sub-G1 increased in NCI-H3122. Subsequent experiments confirmed that pemetrexed induced apoptotic cell death early in NCI-H3122 compared to other cells. After exposure to each cell line for about 15 months with increasing concentrations of pemetrexed, pemetrexed-resistant cell lines of A549, NCI-H460, and NCI-H3122 were established. Pemetrexed-resistant cell lines were inferior in colony forming capacity as compared to the parental cell lines. When the expression levels of the receptor tyrosine kinase family -related protein in the parent and resistance cells were compared in each cell line, the pemetrexed-resistant NCI-H3122 cell line showed an increased expression of EGFR and HER2 compared to the parental cell line. Since this change was not dependent on the levels of EGFR ligands, it appears to be due to genetic changes in the cell. The pan-HER inhibitor, afatinib, inhibited this alternative signaling pathway, resulting in a superior cytotoxic effect in pemetrexed-resistant NCI-H3122 cell lines than in parental cells. Afatinib also suppressed expression levels of several proteins of the receptor tyrosine kinase signaling pathway and hypoxia-inducible factor 1 alpha in pemetrexed-resistant NCI-H3122 cells, suggesting the possibility as a means to overcome resistance to pemetrexed. Conclusion : The NCI-H3122 cell line harboring EML4-ALK variant type 1 rearrangement was more susceptible to pemetrexed-induced cell death than other cell lines. When NCI-H3122 cell lines acquire resistance to pemetrexed, the expression of EGFR and HER is increased compared to the parent cell line. These results suggest that the alternative activation of EGFR-HER signal pathways may contribute to the acquisition of resistance to pemetrexed by non-small-cell lung cancer cells that are EML4-ALK rearrangement. Inhibition of this alternative survival signaling pathway with afatinib overcame this resistance.