Structural and Functional studies of VapBC and SehAB from Salmonella enterica Typhimurium LT2

Abstract

세균성의 독소-항독소 시스템은 영양부족, 항생제 처리, 산화스트레스 등의 세포가 힘든 환경에 처했을 때 세포의 유지에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 주목받고 있다. 독소-항독소 시스템은 항독소의 독소 저해 방식 혹은 항독소의 형태에 따라 6가지 독소-항독소 시스템이 존재한다. 그 중에서 타입 2 독소-항독소 시스템은 가장 많이 연구가 진행되었다. 타입 2 독소-항독소 시스템은 상대적으로 불안정한 항독소 단백질과 안정적인 독소 단백질로 구성되어 있다. 세포가 안정적인 환경에서는 독소와 항독소는 복합체를 형성하고 있지만 세포가 산화스트레스, 온도변화, 영양부족, 항생제 처리 등의 척박한 환경에 놓이게 되면 특정 단백 분해 효소에 의해 상대적으로 불안정한 항독소가 분해되고 유리된 독소는 특정 RNA를 분해하는 등의 활성을 나타냄으로써 세포가 사멸하거나 혹은 생장이 멈춘다. 타입 2 독소-항독소 시스템의 항독소의 구조에는 DNA와 결합하는 도메인이 포함되어 있는데, DNA와 결합하는 도메인을 통해 프로모터 지역의 특정 서열과 결합하여 독소와 항독소의 전사를 조절한다. 이러한 타입 2 독소-항독소 시스템의 특성은 새로운 항생제 타겟으로 주목받고 있다. 병원성 균인 살모넬라 티피뮤리엄에는 최소 14개의 타입 2 독소-항독소 시스템이 존재하며 이제까지 밝혀진 구조는 없다. 우리는 이번 연구를 통해 VapBC 독소-항독소 복합체 구조를 결정화를 통해 DNA와 결합하지 않은 그리고 결합한 구조를 각각 2 Å 그리고 2.8 Å 으로 구하였다. VapC 독소는 구조 속에 PIN domain (pilT N-terminal domain) 을 가지고 있다. PIN domain을 가지고 있는 VapC 독소는 금속 의존적 RNA 분해 능을 가진다. 또한 구조적으로 음전하를 띤 잔기들을 활성 부위에 가지고 있다. 선행된 VapBC 연구에서 기존의 VapC 독소는 마그네슘 혹은 망간 의존적인 RNA 분해 능을 보인다고 보고되었다. 하지만 우리는 처음으로 칼슘 의존적인 RNA 분해 능을 보이는 VapC 독소 단백질을 발견하였다. VapB 항독소 단백질에는 N 말단에 Abr-B DNA 결합 domain을 가지고 있으며 이 DNA 결합 domain이 프로모터 지역의 특정 서열과 결합하여 VapBC 복합체의 전사를 조절한다. DNA와 결합된 VapBC 구조를 통하여 VapB 항독소가 DNA와 결합하는 형태와 결합에 관여하는 잔기를 관찰할 수 있었다. 또한 SehAB 복합체의 구조를 결정화를 통해 2.49 Å 으로 구하였다. SehA 독소는 RelE 독소 계열로 알려져 있으며, RelE 독소는 리보솜 의존적인 RNA분해능을 보인다. SehA 독소는 RelE 계열의 독소이므로 RNA 분해 능을 보일 것으로 예상되어, 형광-퀜처 실험을 이용하여 RNA 분해 능을 측정해본 결과 SehA 독소의 C 말단 알파 나선이 독소의 활성에 영향을 준다는 것을 밝힐 수 있었다. SehB 항독소는 C 말단에 DNA 결합 도메인인 Helix-Turn-Helix를 가지고 있다. SehAB 복합체의 구조를 통해서 SehB 항독소와 SehA 항독소의 결합에 관여하는 잔기들을 관찰 할 수 있었고, SehB 항독소가 SehA 독소를 제어하는 방식을 관찰할 수 있었다. 본 연구에서는 DNA와 결합한 VapBC와 결합하지 않은 VapBC 구조를 관찰할 수 있었고, 이 구조를 근거로 VapB 항독소의 VapC 독소 제어를 관찰할 수 있었다. DNA와 결합한 VapBC 복합체 구조를 바탕으로 여러 균주 유래의 VapBC를 포함한 VapBC 복합체의 전반적인 DNA와의 결합 양상 관찰할 수 있었다. 또한, 처음으로 칼슘 의존적인 RNA 분해 능을 보인 VapC 독소를 밝혀내었다. DNA와 결합한 VapBC 복합체 구조는 현재까지 두 개의 균주에서 유래한 구조만 보고되었으며, 또한 칼슘 의존적 RNA분해능을 보이는 VapC는 처음으로 보고되었다. 이번 연구에서 밝힌 결과들은 향후 VapBC 연구의 발전에 기여할 것이다. 또한, 결정화를 통해 구한 SehAB 복합체 구조를 구하였고 구해진 구조를 바탕으로 SehA 독소와 SehB 항독소의 결합에 관여하는 잔기들을 관찰할 수 있었다. 또한 RNA 분해 능 실험을 통해 SehA 독소의 RNA 분해 능에 영향을 끼치는 요소들을 규명할 수 있었다. SehAB는 유사체와 달리 SehB 항독소가 SehA 독소의 활성 부위와의 직접적인 결합 없이 SehA 독소의 활성을 제어하는 양상을 보이는데, 이러한 SehAB 만의 독특한 결합 양상은 SehAB 복합체가 연구 주제로서 충분한 의의를 지닌다는 것을 말해준다. 살모넬라 균은 현재까지도 경제적으로 발전이 더딘 국가에 널리 퍼져있으며 기존의 항생제에 대한 내성 또한 증가하고 있다. 그러므로 새로운 기전의 항생제 개발은 살모넬라균의 치료에 많은 도움을 줄 것이다. 이번 연구에서 밝힌 3가지 독소-항독소 복합체 구조는 독소-항독소의 간의 구조적, 기능적 정보를 제공하였고 또한 본 연구에서 밝힌 독소-항독소의 구조적 특징과 기능은 독소-항독소 구조를 이용한 새로운 항생 후보 물질 개발에 초석이 될 것이다.

Bacterial toxin-antitoxin (TA) system has gained attention for its essential roles in cellular maintenance and survival under harsh environmental conditions such as nutrient deficiency, antibiotic treatment and oxidative stress. The TA systems are generally classified into six types, according to the structure of antitoxin or mode of inhibition toxin activity by antitoxin. Among them, type 2 TA systems are the most studied. The type II TA system is composed a labile antitoxin and a stable toxin. Under normal environments, the antitoxin protein binds to its cognate toxin and forms a stable complex to inhibit the toxic effects. However, under stressful environments accompanying with oxidative stress, temperature changes, starvation caused by malnutrition, and treatment of antibiotics, kinds of proteases which were produced by host cells degrade the antitoxin molecules and allow its cognate toxin to be released. This situation can lead to deaths or growth inhibition of the host cells. All type II TA operons are autoregulated at the transcriptional level by antitoxins, which bind to TA locus promoters. Type II antitoxin usually has a DNA-binding domain at the N-terminus of the protein, while the C-terminus of the antitoxin protein interacts with cognate toxin. This DNA-binding domain has a domain such as RHH (Ribbon-Helix-Helix), HTH (Helix-Turn-Helix), PhD like-, or AbrB-like domain. There are at least 14 type II TA systems in Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2, one of pathogenic bacteria, and none of their structures have been determined. We determined the crystal structure of the VapBC TA complex from S. Typhimurium LT2 in DNA-free and –bound forms at 2 Å and 2.8 Å resolution, respectively. The VapC toxin possesses a PIN-domain ¬that shows metal dependent ribonuclease activity. The PIN domain has four acidic residues that form a negatively charged cavity. We were identified VapC from S. Typhimurium LT2 as a putative Ca2+-dependent ribonuclease using a fluorescence quenching assay, which is discriminated from previous data showing that VapC homologs have Mg2+ or Mn2+-dependent ribonuclease activities. The VapBLT2 possesses a Abr-B type DNA binding domain which is regulate transcription of VapBCLT2. Additionally, we revealed the crystal structure of the SehAB TA complex from S. Typhimurium at 2.49 Å resolution. SehA toxin shares RelE toxin ¬¬protein features that shows ribosome dependent ribonuclease activity. The SehA toxin is expected to show ribonuclease activity also. As a result of measuring ribonuclease activity of SehA toxin, we could reveal that C-terminal alpha helix of SehA toxin have a significant effect on toxin activity. The SehB antitoxin has a Helix Turn Helix–type DNA binding domain on the C-terminal. Based on the structure, we can see the way SehB antitoxin inhibits SehA toxin. The DNA-bound and –free VapBC structures revealed details of interaction mode between VapBC and the cognate promoter DNA, including the steric inhibition of the VapC active site by VapB and the linear conformation of bound DNA in the VapBC complex. It also revealed the first VapC toxin that showed Ca2+-dependent ribonuclease activity. We could observe the unique SehA toxin and SehB antitoxin binding mode through the SehAB complex structure and found the factors affecting the activity of SehA toxin. Salmonella has spread to many countries where economic development is slow to this day, and resistance to existing antibiotics is also increasing. Therefore, the development of new antibiotics is expected to be of great help in the treatment of Salmonella. The three toxin - antitoxin complexes identified in this study provided the binding and structural information of the toxin-antitoxin, and the structural features and functions of the toxin-antitoxin described in this study will be a cornerstone in the development of new antibiotic candidates.