Cooperative interplay between macrophages and cancer cells for inflammasome activation in breast tumor microenvironment

Abstract

종양미세환경은 암세포, 내피세포, 섬유아세포, 골수유래세포, 암-연관 섬유아세포, 면역세포 등 다양한 세포들로 이루어져 있고, 이러한 종양미세환경 내에서의 이질성(heterogeneity)은 종양이 갖는 특징 중 하나이다. 그중 높은 비율의 염증성 세포와 염증 매개 물질들의 존재에 따른 염증성 종양미세환경은 많은 종류의 암이 가지는 또 다른 특징 중 하나이며, 이들이 분비하는 사이토카인(cytokine), 키모카인(chemokine), 성장인자(growth factor) 등을 통한 상호작용은 종양의 증식 및 발달, 전이에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 인플라마좀(inflammasome)은 거대 단백질 복합체로서 외부로부터의 병원균의 감염에 의한 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), 혹은 손상된 조직이나 세포들이 분비하는 damage-associated molecular patterns (DAMPs)과 같은 비 미생물 성분의 자극에 의해 IL-1β를 분비함으로써 염증반응을 촉진시킨다. IL-1β는 강력한 전 염증성 사이토카인 중 하나로 감염 부위로 다양한 염증성 세포들을 불러들여 선천면역반응을 증폭시킴으로써, 생체 항상성 유지와 방어기전으로 필수적인 역할을 수행한다. 면역반응에 있어서 인플라마좀과 IL-1β가 가진 이러한 필수적인 역할로 인해, 비 특이적인 발현의 인플라마좀과 IL-1β는 암을 비롯한 다양한 면역관련 질환과 밀접한 관련이 있다고 보고되었다. 하지만 이러한 비 특이적인 발현의 인플라마좀과 IL-1β가 유방 종양의 발달 및 증식, 전이에 미치는 영향 및 그 역할에 관해서는 아직 논란이 있으며, 유방 종양 미세환경에서 비 특이적인 인플라마좀과 IL-1β의 발현 기작에 관해서는 아직 연구가 미비한 실정이다. 따라서, 본 논문에서는 IL-1β가 유방암의 증식 및 전이에 미치는 영향과 유방 종양 미세환경에서 IL-1β의 분비 기작에 관해 연구를 진행하였다. 먼저 유방암과 염증성 미세환경사이의 관련성을 확인하기 위하여, 유방암 환자와 정상 대조군의 혈청 내 염증성 사이토카인을 확인한 결과, 전 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-18, TNF- 모두 유방암 환자의 혈청 내에서 정상 대조군에 비해서 월등히 높은 수치를 보였고, 특히, 그 중에서 IL-1β의 경우에는 정상 대조군 보다 약 40배 이상의 증가된 평균 수치를 보였다. 이와 유사하게, 4T1-BALB/c 동소위 유방암 마우스 모델에서 4T1 세포를 이식하지 않은 정상 마우스와 비교하였을 때, 유방암이 발생한 마우스의 혈청 내 IL-1β가 정상 마우스에 비해 증가되는 것을 확인하였다. 또한, IL-1수용체가 결핍된 4T1 세포를 이용한 4T1-BALB/c 동소위 유방암 마우스 모델에서 감소된 원발성 유방 종양의 증식과 폐 전이가 확인되었다. 위 결과들을 미뤄보았을 때, 유방암의 발달 및 진행, 전이는 IL-1β-IL-1수용체를 통한 신호전달 체계와 밀접한 관련이 있다는 것을 시사한다. 유방 종양 미세환경에서 증가된 IL-1β의 출처를 확인하기 위해 실시한 동시 배양 실험과 유방암세포주 배양액 처리 실험을 통해서 삼중 음성 유방암 세포(triple negative breast cancer)가 분비한 수용성 물질에 의해 대식세포의 인플라마좀 활성화를 통해 IL-1β의 분비가 증가된 것을 확인하였다. 또한, 4T1-BALB/c 동소위 유방암 마우스 모델에서 대식세포를 겹핍 시켰을 때, 마우스 혈청 내 IL-1β 농도가 감소하였고, 원발성 유방 종양의 크기와 폐 전이가 모두 감소하였다. 이는 유방 종양 미세환경에서 증가된 IL-1β는 유방암 세포가 분비하는 수용성 물질에 의해 대식세포에서 IL-1β의 분비가 촉진된 것임을 시사한다. 유방암 세포주가 분비하는 수용성 물질 중 대식세포에서 IL-1β의 분비를 증가시키는 물질을 동정하기 위하여 인간 유방암 세포주의 secretome을 분석한 결과, CD44가 비 삼중음성유방암 세포주와 비교하였을 때 삼중 음성 유방암 세포주에서 가장 많이 분비되는 것을 확인하였고, 또한 유방암 환자의 혈청 내 CD44의 농도가 정상 대조군에 비해 월등히 높은 수준을 보였다. 대식세포에서 IL-1β의 분비는 CD44를 중성화 시킨 삼중 음성 유방암 세포주의 세포 배양액을 대식세포에 처리하였을 때 유의미하게 감소하였고, 4T1-BALB/c 동소위 유방암 마우스 모델에서 CD44를 중성화 시켰을 때 원발성 유방 종양의 증식과 폐 전이, 그리고 혈청 내 IL-1β의 농도가 감소한 것을 확인하였다. 위 결과들을 종합했을 때, 유방 종양 미세환경에서 유방암 세포주의 세포막으로부터 분비된 CD44는 대식세포에서 인플라마좀의 활성화를 일으키고, 그로 인해 증가된 IL-1β의 분비로인하여 유방암의 발달 및 진행, 그리고 전이가 촉진된다는 것을 알 수 있다. 따라서 CD44의 표적 치료는 CD44가 지닌 유방 종양의 악성화에 미치는 영향뿐만 아니라, IL-1β에의해 유도된 염증성 종양미세환경의 조절을 통한 유방 종양의 증식 및 전이 억제 효과까지 기대할 수 있다.

Similar to heterogeneous tumor mass made up of multiple subtypes of cancer cells, stromal cells are also highly variable and heterogeneous. Heterogeneity of tumor is considered to be a major cellular feature of cancer due to the presence of not only different populations of cancer cells, but also distinct composition of stromal cells and their expression signatures within the tumor microenvironment. Stromal cells in the tumor microenvironment include lymphatic endothelial cells, T and B lymphocytes, tumor-associated macrophages, cancer-associated fibroblast, adipocytes, etc. These cells interact with cancer cells as well as each other through complex and dynamic network of cytokines, chemokines, growth factors, and hormones. Crosstalk among the cells in the tumor microenvironment exerts fate-determining roles in many types of cancer. The presence of inflammatory cells and pro-inflammatory mediators in the tumor microenvironment has been considered as another hallmark of cancer. The inflammatory tumor microenvironment has both tumor progressive and tumor suppressive aspects, and such interchangeable roles of the inflammatory tumor microenvironment mainly depend on the stages of cancer development and types of cancer. Inflammasomes are multi-protein complexes, which play essential roles in maintaining bodys homeostasis as the first line of host defense against infections and damaged tissues by releasing interleukin (IL)-1β and IL-18 in innate immunity. IL-1β, one of the most potent pro-inflammatory cytokines, is involved in establishment of inflammatory conditions by mediating a systemic pro-inflammatory cascade. Overexpression/secretion of IL-1β, as a consequence of aberrant activation of inflammasomes mainly in tumor-associated macrophages, has been observed in many types of human malignancies, such as liver, lung, gastric, and colorectal cancer. However, the roles of IL-1β in the breast tumor microenvironment, especially in the context of interplay between cancer cells and tumor-associated macrophages, are still unclear. In the present study, increased serum levels of IL-1, IL-6, IL-18, and TNF- were observed in breast cancer patients. Secretion of IL-1β was increased by the co-culture of human monocyte-like cells and triple negative breast cancer (TNBC) cells. Additionally, the conditioned-media from TNBC cells potently induced IL-1β secretion by macrophages. Consistent with these observations, macrophage depletion reduced the serum levels of IL-1β, and alleviated breast cancer progression in a murine orthotopic breast tumor model. Profiling the secretome of human breast cancer cells revealed that the CD44 antigen was the most differentially released protein in basal conditions of TNBC cells. Antibody neutralization of CD44 abrogated IL-1β production in macrophages, and inhibited the growth and metastasis of primary tumors. These results suggest that IL-1β-mediated oncogenic signaling is stimulated, at least in part, by soluble CD44 (sCD44) derived from breast cancer cell membrane, and targeting sCD44 antigen may hence provide an alternative therapeutic strategy for breast cancer treatment by modulating the inflammatory tumor microenvironment.