Studies on the role of ALK in tau proteinopathy and its implications in Alzheimers disease

Abstract

타우 단백질은 Aβ (beta amyloid) 단백질과 더불어 알츠하이머병에서 보이는 가장 대표적인 병리적 단백질이다. 알츠하이머병을 겪고 있는사람의 뇌에는 타우 단백질이 인산화되어 있거나, 더 나아가 타우단백질끼리 뭉쳐서 생성된 응집체 (aggregates)가 발견된다. 인산화된 타우는 정상적인 타우보다 더 응집하기 쉬워서 매듭 형태를 이루기가 쉽기 때문에 높은 독성을 가진다고 여겨진다. 타우(tau)는 미소관(microtubule)과 결합하여 안정화시키는 역할을 하는 단백질로, 타우단백질의 인산화와 축적은 알츠하이머병에서 나타나는 기억력 손상 외에도 다양한 종류의 타우 병증 (tauopathy)와 신경퇴행성 질환과 연관되어 있다고 알려져 있다. 타우를 조절하는 기작에 대한 연구는 대부분 타우의 인산화를 조절하는 인산화 효소와 그 인산화 효소를 포함하는 신호 전달에 관한 것이다.ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase)는 후기 배아 단계에서 중추 신경계와 말초 신경계의 신경세포에서 발현되는 수용체인산화효소(receptor kinase)이다. ALK가 돌연변이가 생기거나 다양한 단백질과 융합이 일어났을 때, 비소세포성 폐암, 신경아세포종 등과 같은 암을 일으키는 암유발인자로써 역할을 한다. 이처럼, 이전의 ALK 관련 연구는 ALK의 돌연변이 또는 융합 단백질 발현으로 인한 종양형성에서의 역할에 대한 내용으로 국한되어 있다. 본 연구는 신경세포에서 발현되는 ALK가 타우 단백질의 과인산화와 축적을 조절하여 타우 단백질에 의한 신경세포의 병리학적 현상에서의 기능을 규명하였다. 본 실험실이 보유하고 있는 630개의 인산화 효소와 2,000개의 막단백질을 포함한 4,000개의 cDNA library를 대상으로 GFP-tau응집 screening을 진행한 결과, 타우 응집을 증가시키는 유전자로 ALK를 발굴해 내었다. 더불어, 각각 6, 9, 12 개월 령의 야생형 쥐와 한배 새끼인 ALK 손실 쥐의 해마와 피질 조직을분석한 결과, ALK의 부재가 타우 단백질의 양을 감소시키는 것을 관찰하였다. 흥미롭게도, ALK에 의한 타우 단백질의 축적은 자가포식 소체의 저해로 인한 것임을 p62와 LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ 양이 증가하는 것을 통해 밝혔고, 또한 mCherry-GFP-LC3와 GFP-Stx17, RFP-LC3의 공존의 정도를 조사한 결과, ALK가 자가포식 소체가 자가용해 소체로 발달하는 것을 저해하는 것을 증명하였다. ALK의 downstream에 존재하여 신호전달을 매개하는 단백질로 Grb2를 screening을 통해 발굴하였으며, Grb2와 ALK의 상호작용 또한 관찰하였다. ALK.Fc 과발현 시에 신경세포의 축색돌기에 LC3 양성인 부기가 발생하였고, 신경세포의 퇴화 (degeneration)의 표지가 되는 가지돌기 가시 밀도 (dendriticspine density)가 감소하는 것을 관찰하였다. 또한, 쥐 일차 신경세포에서 ALK agonistic antibody를 통해 ALK를 활성화시키면 세포 사멸이 증가하였다. in vivo 에서 앞서 관찰한 내용을 재현하기 위해 5-6 개월령 야생형 쥐와 알츠하이머병모델인 3xTg-AD 에 stereotaxic 방식으로 ALK.Fc를 과발현하는 lentivirus를 주입하고 1 개월 후에 기억력과 타우 단백질의 변화를 관찰한 결과, 공간 기억력을 측정하는 Y-maze, 학습과 기억력을 측정하는 신물질 탐색 시험 (novel object recognition test), 명시적 기억능력검사인 수동 회피 실험 (passive avoidance test) 총 3가지 기억력 실험을 통해서 야생형과 3xTg-AD 모두에서 ALK 과발현 시킬 경우 기억력이 저해되었다. 기억력 실험 후, 쥐 뇌의 해마부분 (Hippocampus)를 단백질 발현 분석법으로 분석 결과, 인산화된 타우의 양이 증가한 것 또한 확인하였다. 다음으로는 ALK의 억제가 생체 내에서 보이는 효과를 살펴보기 위해 7개월령 대조군인 야생형 쥐와 실험군인 3xTg-AD 쥐에 ALK의 저해제인 Ceritinib를 한 달간 복부 투여를 수행한 후, 쥐들의 기억력을 행동 실험을 통해서 조사한 결과, 알츠하이머 표현형을 가지는 3xTg-AD에서 떨어졌던 기억력이 Ceritinib을 투여했을 경우 대조군인 야생형 쥐의 기억력 정도로 회복하는 것을 확인하였다. 더불어 3xTg-AD에서 증가하였던 타우단백질의 양과 인산화가 Ceritinib을 투여한 그룹에서는 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. 나이 든 정상인과 알츠하이머병 환자의 해마 부분 뇌 조직을 단백질 발현 분석법을 통해서 분석한 결과, 정상인에 비해서 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 훨씬 더 높은 ALK의 발현을 확인하였다 또한, 알츠하이머병 환자의 해마 조직을 면역조직화학 방법으로 조사한 결과, ALK와 신경섬유 매듭이 공존하고 있음을 발견하였다. 이러한 결과를 통해 ALK가 자가포식 소체의 성숙을 저해함으로써 타우 축적을 촉진하며, 신경세포에서의 세포사멸을 일으키고 알츠하이머병에서 보이는 타우 병리와도 연관성이 있음을 결론지을 수 있다. 앞의 결과를 통해서 ALK가 치매에서 보이는 타우에 의한 신경독성을 일으키는 원인이 된다는 것을 알 수 있었고, 치매 치료제의 첫 단계가 될 수 있는 새로운 ALK 저해제와 항체를 발굴, 조사하는 실험을 진행하였다. LegoChem Biosciences이 docking study를 통해 ALK의 hinge 부분에 결합하여 ALK의 키나아제 활성을 억제한다고 찾은 KRCA0605의 in vivo에서의 기능을 밝히는 실험을 수행하였다. 7개월령의 3xTg-AD 모델 쥐에 10 m.p.k.의 KRCA0605를 한 달간 경구투여 하였을 때, 3xTg-AD 모델 쥐의 손상된 기억력이 회복되는 것을 확인하였고, 또한 인산화된 타우와 전체 타우의 양이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 ALK의 타우를 통한 신경퇴행 기능을 다시 한번 확인시켜주며, KRCA0605의 치매 치료제로써의 가능성을 제시하였다. 또한, ALK가 과발현이 되었을 때 ERK를 통해 ELK1을 활성화하는 사실을 이용하여 새로운 ALK 저해 reporter assay를 고안하고 assay를 이용하여 BBB를 통과하는 1568개를 대상으로 screening을 진행하였고 이 중에 형광 세기를 낮추는 화합물로 총 5개를 발굴하였다. 단백질 발현 분석법을 통해서 5개의 화합물 모두 ALK를 저해하는 효과를 보이고, GFP-Tau를 이용한 tau dot counting 실험을 통해서는 1, 2, 5번의 화합물이 타우 응집을 억제하는 결과를 관찰하였다. 반면 in vitro kinase assay 결과에서는 해당 화합물들이 ALK의 인산화 효소능력에는 아무런 영향도 끼치지 않는 것을 보아, ALK의 활성 자리가 아닌 부위를 대상으로 한다는 것을 유추할 수 있다. ALK 저해제 발굴과 동시에 K-BIO 김대영 박사님 신항체발굴팀과 협업하여 ALK와 결합하는 항체 중에서 agonistic 혹은 antagonistic 효과를 보일 수 있는 항체를 발굴하는 실험을 진행한 결과 항체 library에서 human ALK와 결합할 수 있는 추정 상의 항체 14종을 선별하였고, FACS 분석법을 통해서 14종 중에 7종의 항체가 세포에서 발현된 ALK와 결합한다는 것을 확인하였다. 더 나아가 4종의 항체가 ALK를 활성화시키고 타우의 축적도 증가시키는 agonistic 항체임을 단백질 분석법을 통해 밝혔다. 위의 실험 결과들을 모두 종합하면, 알츠하이머병 발병에서 ALK가 가지는 역할과 기능을 새롭게 밝힘으로써 알츠하이머병이 발병하는 기작에 대한 이해를 높이고, 궁극적으로는 알츠하이머병에서 보이는 기억력 저하를 회복시킬 수 있는 치료제 개발에 대한 기반을 마련하였다.

ALK is a receptor tyrosine kinase (RTK) that belongs to the insulin receptor superfamily. Aberrant ALK activity has been highly implicated in the oncogenesis of human cancer as a fusion protein in inflammatory myofirbroblastic tumor, diffuse large B-cell lymphoma and anaplastic large-cell lymphoma (ALCL) or through mutations in full-length protein in hereditary familial neuroblastoma. Thus, ALK is being employed as a therapeutic target for the prevention of cancer. On the other hand, its role in the neurodegeneration and AD pathology is not known. In chapter 1, I report that ALK is responsible for the tau-mediated AD pathology. Through cell-based functional screening using human 650 kinase cDNAs in hippocampal HT22 cells, ALK, a neuronal receptor tyrosine kinase, was selected to increase the level of phosphorylated form of tau. ALK caused abnormal hyperphosphorylation of tau and its accumulation in the somatodendritic region of neurons through its tyrosine kinase activity, while tau levels were reduced in the brains of Alk knockout mice. Notably, ALK activation in neurons impaired autophagosome maturation and this defect was reversed by dominant-negative Grb2. ALK induced LC3-positive axon swelling and loss of spine density, leading to tau-dependent neuronal degeneration. ALK levels were significantly elevated in the brains of AD patients, and injection of an ALK.Fc-lentivirus exacerbated memory impairment in 3xTg-AD mice. Conversely, administration of ALK inhibitors reversed the memory impairment and tau accumulation in both 3xTg-AD and tauC3 mice. Together, I propose that aberrantly activated ALK is a bona fide mediator of a proteinopathy that disrupts autophagosome maturation and causes tau accumulation, leading to neuronal dysfunction in AD. Further research attempted to find tools regulating ALK activity. In chapter 2, I identified prospecting non-active site ALK inhibitors and putative ALK agonistic antibodies, and also demonstrated in vivo effect of KRCA0605, ALK inhibitor targeting its kinase activity. Using Gal4-UAS system, 5 putative ALK inhibitors were identified in the screening. Those compounds inhibit ALK acitivty and ALK-mediated tau accumulationand aggregation in cell based-assay. Those inhibitors is proved to regulate ALK activity by targeting non-active site via in vitro kinase assay. In addiftion, I investigated the in vivo effect of another ALK inhibitor, KRCA0605 which is initially developed for treating cancers, on memory defects and tau accumulation of 3xTg-AD mice. As expected, oral administration of KRCA0605 diminished memory impairment and tau accumulation in the AD mice model. Lastly, I demonstrated the interaction between human ALK and putative ALK antibodies which are identified via phage antibody spanning. I also found that at least two of them function as agonistic antibodies, thus activate ALK activity and increases tau protein in cells. Taken together, I discovered inhibitors and antibodies to manipulate ALK activity, thus provide useful tools for manipualting ALK functions.