Structural Optimization for Thermal Stabilization of Adenylate Kinases : 열 안정성 향상을 위한 아데닐레이트 카이네이즈 구조적 특성 연구

DC Field Value Language
dc.description학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 농생명공학부 응용생명화학전공, 2016. 8. 배의영.-
dc.description.abstract열에 안정한 단백질은 반응의 효율을 증가시키는 측면과 효소 저장 및
운반에 이용되는 비용 절감 등의 산업적, 실험적 환경에 필수적이다.
따라서, 이를 위한 단백질 재 디자인 방법들이 오랜 기간동안 다양한
시도들이 연구되고 있다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 알려진 방법들은
이의 결과들이 예측이 힘들고, 재디자인 결과가 열 안정성에 크게
영향을 주지 않는 문제점을 가지고 있다. 본 연구자는, 여러가지 열
안정성에 관련된 기술들의 효과를 테스트 하였다. 이를 바탕으로,
개별적이고 통합적인 방법으로 단백질을 재디자인하여 어떠한
메커니즘이 단백질 열 안정성에 영향을 미치는 역할을 하는지 제공한다.
본 연구의 모델로서, 중온성 아데닐레이트 카이네이즈 (AKmeso) 에
바이오인포메틱스 방법인 local structural entropy 최적화, 삼차원적
구조를 바탕으로한 돌연변이 생성, 분자생물학적인 진화법을
적용하였다. 이 방법들을 개별적과 통합적으로 적용하여, 아데닐레이트
카이네이즈 돌연변이 (AK variants) 를 생성하고, 각 AK variant 의 열
안정성을 측정하였다. 재 디자인된 AK variants 는 야행형인 AKmeso
보다 향상된 열 안정성을 가지며, 높은 온도에서 효소 활성을 나타냈다.
호열성인 아데닐레이트 카이네이즈와 유사한 열 안정성을 가지는 AK
variant 인 AK v18 을 포함하여, 디자인에 관련된 대표적인 AK variants 의
단백질 결정을 이용한 삼차원적 구조 규명 하였다. 이를 통하여, AK
variants 의 단백질 구조를 확인하였고, AK variant 에 적용된 열 안정성
관련 방법의 효과를 분석하였다. 이러한 실험의 결과를 통하여,
아데닐레이트 카이네이즈의 열 안정성과 관련된 메커니즘의 역할를
확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 열에 안정한 단백질을 디자인 함에
있어서, 여러 방법들을 개별적 및 통합적으로 이용하였을 때, 보다
효과적으로 적용시킬 수 있는 방법을 제시하고 있다.
dc.description.abstractThermally stable proteins are desirable in many industrial and laboratory
settings. Numerous approaches have been developed to redesign proteins for
higher thermal stability. However, these approaches are sometimes
unpredictable and bring no significant change. In this study, I systematically
tested the effects of multiple stabilization techniques, thereby suggesting an
integrated approach for improving protein thermal stability. Using a
mesophilic adenylate kinase from Bacillus subtilis (AKmeso) as a model
protein, I identified mutations important for thermal stability, based on
various techniques including local structural entropy optimization, structureguided
mutagenesis, and molecular evolution. Variants of adenylate kinase
(AK) harboring single or multiple mutations were generated and the changes
in their thermal stabilities were measured. Compared to AKmeso, the AK
variants displayed higher thermal denaturation midpoints with retained
enzymatic activity at high temperatures. In addition, I solved crystal structures
of representative AK variants to confirm the effects of the generated
mutations affecting the thermal stability. These results provide a unique
example of the integrated and systematic approaches for protein thermal
dc.description.tableofcontentsIntroduction 1
Protein thermal stabilization 1
Importance of protein stability 2
Adenylate kinase 3
Bacillus adenylate kinase 7
Previous approaches on Bacillus AKs thermostabilization 13

Materials and Methods 28
Cloning 28
Protein expression and purification 30
Determination of Tm values 31
Activity assay 33
Crystallization 34
X-ray data collection and structure determination 36
Structure analysis 37
Data deposition 38

Results 39
Part I Integrated Approach for Thermal Stabilization of AKmeso 39
Identification of stabilizing mutations for AKmeso 39
Generation AKmeso variants for thermally stable AKs 40
Measurement of thermal stability of AKmeso variants 41
Crystal structures of AKmeso variants 50
Structural analysis of AKv3 56
Structural analysis of AKv8 63
Structural analysis of AKv18 68
Part II Effectiveness and Limitation of LSE Optimization for Thermal Stabilization of AKs 76
Thermal stabilization by LSE optimization was effective but limited in mesophilic AK 76
Structural analysis revealed a strong correlation between LSE and apolar buried surface area 81
LSE optimization overlooks and can damage stabilizing noncovalent interactions that connect distant regions of a polypeptide 91
Structure determination of AKlse4 mutants 101
Introduction of ion pairs connecting distant regions of AKlse4m1 108
Optimization of hydrophobic contacts for thermal stabilization in AKlse4m2 109
LSE optimization of thermophilic AK resulted in decreased thermal stability 114

Discussion 125

References 140

Supplementary Materials 144

Abstract in Korean 153
dc.format.extent7101856 bytes-
dc.publisher서울대학교 대학원-
dc.subjectadenylate kinase-
dc.subjectthermal stability-
dc.titleStructural Optimization for Thermal Stabilization of Adenylate Kinases-
dc.title.alternative열 안정성 향상을 위한 아데닐레이트 카이네이즈 구조적 특성 연구-
dc.contributor.AlternativeAuthorMoon, Sojin-
dc.contributor.affiliation농업생명과학대학 농생명공학부-
Appears in Collections:
College of Agriculture and Life Sciences (농업생명과학대학)Dept. of Agricultural Biotechnology (농생명공학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._농생명공학부)
Files in This Item:
  • mendeley

Items in S-Space are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.