스트렙토마이세스 에버미틸리스 유래의 티로시나아제를 이용한 카테콜형 구조물질의 생산 및 재조합 티로시나아제의 발현 및 응용에 관한 연구

Abstract

포도 및 견과류에 함유되어 있는 항산화 물질인 레스베라트롤에 수산화 반응을 촉매화하는 효소를 스크리닝 하기 위하여 다양한 종의 방선균주를 비교하였다. 멜라닌 생성 방선균주들은 레스베라트롤의 3 위치에 수산화 작용기가 도입된 피세아타놀을 생산하였다. 그러나 생성된 피세아타놀은 산화 반응으로 인해 농도가 급격히 감소하였다. 대표적인 멜라닌 생성 균주인 Streptomyces avermitilis MA4680 균주의 배양 상등액에서 레스베라트롤이 소모가 되고 피세아타놀이 생산되는 것을 관찰하였다. 세포 외부로 분비되는 단백질 중에서 멜라닌 생성과 관계된 단백질은 티로시나아제이다. 방선균 내에 존재하는 2종의 티로시나아제 유전자를 각각 제거하여 확인한 결과 외부로 분비되는 티로시나아제인 MelC2 티로시나아제가 주효소였다. MelC2 티로시나아제의 유전자가 제거된 경우에는 멜라닌 생성 및 레스베라트롤의 농도 변화가 관찰되지 않았다. 티로시나아제의 반응 속도를 조절하여 피세아타놀의 생산을 증대하는 방법을 제안하였다. 100 μM 레스베라트롤을 초기 기질 농도로 S. avermitilis 균주를 이용하여 피세아타놀을 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 제안하였다. 수산화 반응에 연이은 산화 반응에서 카테콜 형태의 구조가 퀴논으로 산화되는 점을 착안하여 경쟁적으로 반응할 수 있는 카테콜을 1 mM 추가로 반응기에 넣어준 결과 78% 의 생산 수율로 피세아타놀을 축적할 수 있었다. 또한 방선균 유래의 티로시나아제 도움단백질의 서열을 대장균내 최적화하여 티로시나아제와 동시에 발현된 재조합 균주를 제작하였다. 기존에 활용되는 버섯 유래의 티로시나아제에 비해 과량으로 생산할 수 있는 장점을 갖게 되었다. 1 L 배양 조건에서 200 mg 의 정제된 티로시나아제를 생산할 수 있었다. 재조합 단백질이 과발현된 대장균주를 이용하여 다양한 모노페놀형 물질의 수산화반응 연구에 적용하였다. 각각의 기질의 특성에 따라 정상상태로 일정한 양의 카테콜형 물질-피세아타놀, 3-히드록시다이드제인, p-쿠마릭산-을 생산하였다. 제작된 재조합 티로시나아제 뿐만 아니라 티로시나아제 도움 단백질의 효소 개량화를 시도하여 수산화 활성과 산화 활성의 비율을 조절하였다. 티로시나아제 도움단백질의 91 재의 히스티딘 잔기를 다양한 아미노산으로 상호 치환한 결과 티로시나아제의 다양한 발현 양상이 나타났으며 Y91R 와 Y91S 의 경우에는 모노옥시게나아제/디옥시게나아제 활성 비가 야생 티로시나아제보다 낮았으나 단위 단백질당 멜라닌 생성 효율은 5.9 및 8.8 배가 향상되기도 하였다. 용액 내 활성 산소를 제거하기 위한 목적으로 적용이 가능할 것이다. 또한 티로시나아제 자체의 개량화를 시도하였다. 일차적으로 티로시나아제의 활성 부위 주변의 히스티딘 잔기를 아미노산으로 직접 치환하는 시도를 수행하였다. 결과적으로 효소의 활성이 완전히 사라지는 것을 확인하였으며 촉매 반응에 있어서 필수적인 요소임을 확인하였다. 또한 구리 이온 주변의 아미노산을 선택하여 saturation mutagenesis를 수행하였다. 티로시나아제의 이소루신을 치환한 I218A 와 I218S 돌연변이의 경우 야생 티로시나아제에 비해 1.5 배의 모노옥시게나아제/디옥시게나아제 활성의 비율이 향상된 특징을 보이는 효소를 스크리닝하였다. 상업적으로 생산되는 버섯 유래의 티로시나아제와 본 연구에서 제작한 재조합 티로시나아제의 구조와 반응성을 비교한 결과, 상대적으로 버섯유래의 티로시나제는 기질 주입구 부근의 단백질 3차구조로 인한 입체적인 장애 요인으로 고분자형태의 단백질 상의 티로신 잔기 기질은 반응이 어려운 점을 밝혔다. 단일 티로신과 티로신 잔기를 포함하고 있는 젤라틴의 기질 특이성을 확인한 결과 버섯 유래의 티로시나아제의 경우 단 5% 내외의 반응 효율 밖에 나타나지 않는 것을 확인하였다. 티로시나아제를 이용하여 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) 잔기로 생변환 하려는 시도에 있어서, 거대 단백질 분자나 혹은 복잡한 구조를 이루고 있는 기질을 반응할 경우 버섯 유래의 티로시나아제를 사용하는 것은 적절하지 않다. 젤라틴의 성형을 통해 버섯 유래의 티로시나아제와 방선균 유래의 티로시나아제의 가교 결합 효율의 차이를 확인하였다. 젤라틴의 접착력을 비교한 결과 인장강도가 2배 가량 향상되었다. 티로시나아제를 처리한 젤라틴의 경우 열적, 기계적 성능이 향상되었다. 120 ℃ 온도 조건에서도 열적안정성이 유지가 되었으며, 360˚/초 의 회전속도의 뒤틀림 조건에서도 변화가 일어나지 않는 기계적 강도를 확인하였다. 엘라스틴 모사 단백질과 젤라틴 단잭질을 티로시나아 효소를 처리하여 접착력을 강화시키고 응집력을 강화 시켜 젤라틴 비드를 제작하였다. 본 연구 과정에서 제작한 티로시나아제의 고효율로 티로신 잔기의 결합을 유도하여 효소를 고정화 하였다. 젤라틴 비드 제작시 리신 탈탄산 효소를 섞어서 가교하였으며 리신 탈탄산 효소 비드의 경우 한 달 이상 초기 반응속도(0.1 mM/min)를 지속적으로 유지하였다.