간암 세포주에서 진세노사이드의 자가포식 작용 유도

Abstract

자가포식 (autophagy)은 유전적으로 잘 보존된 세포 내 이화 작용으로 세포질 내의 구성 물질을 이중막 구조의 소포체인 자가포식소체 (autophagosome)을 경유하여 lysosome에 의해 분해시키는 과정이다. 이는 불필요한 구성 물질이나 노후한 세포 내 소기관 등을 분해하여 새로운 에너지원으로 이용할 수 있게 하는 일종의 재활용 시스템의 역할을 하며, 대부분의 세포에서 항상성을 유지시키고, 영양소의 결핍이나, 산화적 스트레스, 항암치료제 등의 요인에 의해 상향 조절 (up-regulation) 된다. 암의 형성단계에 있어서 자가포식은 유전자의 안정성을 해칠 수 있는 손상된 미토콘드리아 등을 제거함으로써 암의 형성을 억제하는 작용을 한다. 그러나 암세포에서 자가포식은 두 가지 상반된 역할을 하는데, 항암치료로 인해 유도된 세포자멸 (apoptosis)로부터 생존률을 높이는 세포 보호 작용 (protective action)을 하거나, 혹은 자가포식의 지속적이거나 과도한 진행으로 인해 세포의 사멸을 일으키는 세포계획사의 한 형태로서도 작용한다. 전통적으로 인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer, 오갈피나무과 Araliaceae)은 아시아 국가에서 강장의 목적으로 널리 이용되어 왔으며, 인삼의 주된 활성 성분인 진세노사이드는 dammarane 골격을 갖는 triterpene 계 사포닌으로 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 진세노사이드는 그 비당부 모핵의 골격에 따라 protopanaxatriol (PPT) 계와 protopanaxadiol (PPD) 계 진세노사이드로 분류되고 또한 20번 탄소에 붙어있는 수산기의 입체화학 구조에 따라 20(S) 혹은 20(R)-epimer의 두 가지 형태로 존재하는데, 이 두 가지 이성질체 간 활성이 다르다는 연구 결과들이 계속 보고되고 있다. 본 연구에서는 간암의 유래 세포인 HepG2 세포주를 이용하여, 인삼 추출물로부터 분리된 수 종의 진세노사이드 중에서 autophagy를 유도하는 화합물을 검색하였고, autophagy 유도 활성과 동시에 세포사멸 효과 또한 나타내는 10 종의 진세노사이드를 대상으로 그 구조 별 autophagy 유도 효과와 세포사멸 효과 간의 상관 관계를 탐색해 보았다. PPD 계열의 진세노사이드인 ginsenoside Rg3, Rh2와 그 대사체인 20(S)-protopanaxadiol (PPD)의 20(S)-epimer를 HepG2 세포에 처리했을 때 농도에 비례하여 세포 사멸 효과가 나타났으며, 20(R)-epimer 의 효과는 거의 없었다. PPT 계열의 화합물 중에서는 ginsenoside Rh4와 그 대사체인 aglycone of Rh4, 20(R)-ginsenoside Rh1가 앞선 세 가지 PPD 계열 화합물보다는 높은 농도에서 HepG2 세포의 성장을 억제했으며 20(S)-ginsenoside Rh1의 효과는 거의 없었다. 화합물의 autophagy 유도 활성을 검색하기 위해 autophagy 과정 중 세포 내에서 형성되는 산성의 소포체를 감지할 수 있는 monodansylcadaverine (MDC) 염색법과 LC3 I 단백질에서 LC3 II 단백질로 변화하는 정도를 western blot으로 측정하였다. 그 결과 HepG2 세포 사멸 효과와 마찬가지로 ginsenoside Rh2와 Rg3, PPD의 경우는 20(S)-epimer만이 반대로 ginsenoside Rh1은 20(R)-epimer만이 autophagy를 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다. 그리고 20번 탄소에 이성질체가 존재하지 않는 ginsenoside Rh4와 그것의 aglycone 역시 autophagy를 유도하는 활성을 나타냈다. 또한 autophagy 유도 및 세포사멸 효과를 보이는 진세노사이드에 autophagy 저해제인 클로로퀸 (chloroquine)을 처리하고 세포의 생존률과 세포사멸 양상의 변화를 MTT assay와 유세포 분석 (flow cytometry)을 이용하여 비교 분석하였다. 20(S)-gisenoside Rg3, Rh2, PPD의 경우 HepG2 세포에 대하여 apoptosis를 일으키며 클로로퀸을 동시에 처리했을 때 세포사멸 효과가 더 증가하였다. 반대로 PPT 계열의 20(R)-ginsenoside Rh1과 ginsenoside Rh4는 저해제를 처리한 군에서 세포사멸 효과가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 탐색한 진세노사이드 중 PPD 계열의 Rg3와 Rh2를 대상으로 그 작용 기전에 대해 더 자세히 실험을 진행하였다. 세포사멸 효과를 나타내는 20(S)-Rg3및 Rh2는 PARP cleavage 및 Fas 발현을 증가시키며 Bcl-2 발현을 감소시키는 전형적인 apoptotic 세포사멸의 양상을 보였으나 20(R)-epimer는 변화가 없었다. 또한 전자현미경 및 western blot의 결과 20(S)-epimer만이 HepG2 세포의 미토콘드리아의 기능 및 형태에 손상을 미쳤으며, 그 중 20(S)-Rg3와 20(S)-Rh2 는 미토콘드리아 관련 인자인 OPA-1, UCP-2 및 ATPIF-1의 발현 정도에 서로 다른 영향을 주었다. 더불어 autophagy 저해제인 클로로퀸을 20(S)-Rg3 및 20(S)-Rh2에 동시에 처리한 경우 세포사멸 효과가 더욱 커지는 현상은 세포 내 칼슘 이온의 활성과 관련이 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과 인삼 추출물에서 얻은 dammarane계 사포닌 중 ginsenosoide Rg3, Rh2의 20(S)-epimer와 ginsenoside Rh1의 20(R)-epimer 그리고 ginsenoside Rh4가 HepG2 간암 세포주에 대하여 autophagy 유도 활성과 동시에 세포 사멸 효과를 갖는 것을 확인하였다. 그 중 PPD계 사포닌인 20(S)-ginsenoside Rg3 및 Rh2 는 HepG2 세포에 대한 apoptotic 세포사멸 효과와 동시에 세포 생존을 향한 protective autophagy를 일으키며, 반대로 PPT계 사포닌인 20(R)-ginsenoside Rh1 및 Rh4의 경우는 세포사멸 효과와 동시에 autophagic cell death를 일으키는 것으로 나타나 진세노사이드의 구조-활성간 특이성을 또한 볼 수 있었다. 이로써 인삼의 진세노사이드가 화학구조적 특징에 따라 보다 특이적, 전략적으로 간세포암의 치료제 혹은 보조적 치료제로 개발될 가능성이 있는 것으로 기대된다.

Autophagy is an evolutionarily conserved intracellular degradation system that delivers cytoplasmic constituents to lysosomes via double-membrane vesicles termed autophagosomes. It contributes to the turnover of long-lived proteins and organelles to maintain cell homeostasis, and is also up-regulated under cellular stressful conditions such as nutrient deprivation, hypoxia, oxidative damage and anticancer treatment. In tumorigenesis, autophagy suppresses the progression of normal cell to tumor cell by disposal of damaged mitochondria which is threatening to maintain the chromosomal stability. However, autophagy shows dual roles in tumor cells. It can promote survival of cancer cell by protective action to apoptotic death from cancer therapy or can induce cell death when excessively triggered. Ginseng is the root of Panax ginseng C.A. Meyer (Araliaceae), and has been widely used in Asian countries as a tonic medicine. Its major bioactive components, ginsenosides, are saponins with dammarane skeleton showed diverse biological activities. Depending on their aglycone content, ginsenosides are divided into protopanaxadiol (PPD)-type and protopanaxatriol (PPT)-type ginsenoside. And also, it is well known that stereoisomerism at C-20 influences biological activity of each ginsenoside. In this study, I screened diverse type of ginsenosides from ginseng extract which showed autophagy-inducing effect accompanied by cytotoxicity and compared the activities depending upon the chemical structure of ginsenosides. Among PPD-type ginsenosides, 20(S)-Rg3, Rh2 and their metabolite 20(S)-PPD increased HepG2 cell death in a dose-dependent manner, but their 20(R)-epimers showed no cytotoxic effect. PPT-type ginsenoside Rh4 and its aglycone, 20(R)-Rh1 also decreased the cell viability and the 20(S)-epimer of Rh1 had no cytotoxic activity. Autophay-inducing effect was evaluated using MDC (monodansylcadaverine) which stains acidic autophagic vacuole and western blotting of autophagy marker protein LC3. 20(S)-Rg3, Rh2, PPD and 20(R)-Rh1 increased the number of MDC-stained dot and amount of LC3 II protein, but their other type of epimers showed no effect. PPT-type ginsenoside Rh4 and its aglycon also induced autophagy in HepG2 cell. In order to further investigate the effect of autophagy onto the cytotoxicity, autophagy inhibitor, chloroquine was co-treated with ginsenosides and then analyzed the alteration of cell death extent by MTT assay and flow cytometry method. Inhibition of autophagy with chloroquine enhanced the cytotoxic effect of PPD-type 20(S)-ginsenoside Rg3, Rh2 and PPD, whereas autophagy inhibition increased cell survival against to apoptotic death of PPT-type 20(R)-Rh1 and Rh4. In molecular study, 20(S)-ginsenoside Rg3, Rh2 decreased the expression level of Bcl-2 and up-regulated PARP cleavage and Fas accompanied with mitochondrial damage, in that typical apoptotic cell death were occurred by only their 20(S)-epimers. Moreover, blocking intracellular calcium by BAPTA-AM restored the enforced cell death induced by autophagy inhibition, which means that the interaction between the cytotoxicity and autophagy induced by 20(S)-ginsenoside Rg3, Rh2 is related with intracellular Ca2+ activity. Taken together, 20(S)-ginsenoside Rg3, Rh2 and ginsenoside Rh4, 20(R)-Rh1 triggered autophagy and cytotoxicity simultaneously in HepG2 hepatocarcinoma cell. Among them, PPD-type 20(S)-ginsenoside Rg3, Rh2 induced cytotoxicity accompanied by protective autophagy, while PPT-type ginsenoside Rh4 and 20(R)-Rh1 showed apoptotic and autophagic cell death. Therefore, in the aspects of the usage of ginsenoside as a biologically active agent against HepG2 liver cancer cell, it might be useful to investigate the structure-activity relationship of cytotoxicity and autophagy-inducing ginsenosides.