GPR119 리간드의 비알코올성 지방간 및 섬유화증에 대한 억제 효능

Abstract

비알콜성 지방간질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 진행 경과에 따라 지방간(steatosis)을 시작으로 염증반응을 동반하는 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 나아가 진행 섬유화증(advanced fibrosis) 및 간 경변(cirrhosis)까지 포함하는 질환을 의미한다. 특히 지방간은 간세포 내에 중성지질 함량이 전체 간 무게의 5% 이상을 초과하는 병적 상태로서, 이는 인슐린 저항성 및 간 내 염증 반응을 유도하여 지방간염과 진행 섬유화증을 야기할 수 있다. 지방간 및 간 섬유화증에 대한 치료제는 없는 실정이며 현재까지 밝혀진 약물 표적 분자로는 완치에 한계가 있다. 따라서 간세포의 손상 및 염증 반응의 원인이 되는 간 내 지질 축적과 만성적인 간질환에 따른 간 섬유화증을 조절할 수 있는 새로운 약물 표적 분자 발굴이 중요하다. G protein-coupled receptor 119 (GPR119)는 항 당뇨 치료제로 개발되고 있는 신규 약물 표적 분자이다. 기존 연구결과에서 GPR119의 간 내 발현이 거의 관찰되지 않았으며, 현재까지 지방간 및 간 섬유화증에 대한 GPR119 리간드의 효능에 대해서는 평가되지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 GPR119가 간세포 및 간 성상세포에 상시 발현되어 있음을 PCR 및 면역조직화학을 통하여 확인하였고, 간세포 및 간 성상세포에서의 GPR119 리간드의 효능에 대한 영향을 알아보고자 하였다. GPR119 야생형(wild type, WT) 마우스의 1차 배양 간세포와 비교하여 GPR119 결손형(knock out, KO) 마우스의 1차 배양 간세포에서 지질 합성 효소(acetyl-CoA carboxylase, ACC 와 fatty acid synthase, FAS) 및 liver X receptor (LXR)리간드에 의하여 유도되는 sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1)의 발현이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 비정상적인 간 내 지질 축적 과정에 GPR119가 관여함을 제시한다. 고당/고인슐린 노출에 의한 간세포의 SREBP-1 및 지질 합성 효소 발현 증가와 그에 따른 지질 축적이 GPR119 리간드 처리에 의하여 억제됨을 관찰하였다. 또한, LXR 리간드 처리 시 유도되는 SREBP-1 및 지질 합성 효소의 발현이 임상 진입 GPR119 리간드(MBX-2982, MBX)를 처리하였을 때 억제되는 것을 확인하였다. 다음으로 GPR119 WT과 GPR119 KO 마우스를 이용하여 GPR119 리간드에 의한 지방간 개선효과를 평가하였다. GPR119 WT 마우스에서는 GPR119 리간드 투여에 의하여 고지방 식이로 증가된 간 내 지질 축적과 SREBP-1 및 지질 합성 효소의 발현이 현저히 감소하였다. 하지만 GPR119 KO 마우스에서는 GPR119 리간드 처리에 의한 효과는 나타나지 않았다. 이는 GPR119 리간드의 간 내 지질 축적 억제가 GPR119를 매개하여 나타나는 효과임을 시사한다. 간 내 지질 축적 억제에 대한 신호 전달 경로로서 GPR119 리간드가 AMP-activated protein kinase (AMPK) 활성화를 통하여 SREBP-1을 억제함을 확인하였다. 이상의 결과는 GPR119 리간드가 지방간 치료에 대한 신규 약물 표적 분자로서 이용될 수 있음을 지지한다. 나아가, 세포기반 스크리닝법에 의하여 도출된 GPR119 리간드 후보물질을 활용하여, 고당/고인슐린 자극 시 증가하는 SREBP-1 및 지질 합성 효소 발현을 억제할 수 있는 신규 GPR119 리간드를 도출하였다. 다음으로 NAFLD의 마지막 단계인 간 섬유화 및 성상세포에 대한 GPR119 리간드의 효능에 대하여 평가하였다. 성상세포의 근섬유모세포(myofibroblast)로의 분화 시 유도되는 collagen I 발현과 transforming growth facto beta (TGF beta) 처리에 의하여 증가되는 collagen I과 TGFbta의 발현이 GPR119 리간드 처리에 의하여 억제됨을 성상세포에서 확인하였다. 또한, 사염화탄소(carbon tetrachloride, CCl4)투여에 의하여 유도되는 간 섬유화증 모델에서 GPR119 리간드의 개선 효과를 평가하였다. 간 섬유화 시 증가되는 alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA), collagen I 및 TGFbeta의 발현 및 TGFbeta 수용체 하위 활성화 신호인 Smad2/Smad3의 인산화가 GPR119 리간드 투여에 의하여 억제되었다. 다음으로, 성상 세포의 collagen I 및 TGFbeta 발현 억제는 GPR119 리간드의 AMPK 인산화에 의한 p300과 Smad3의 상호작용 억제를 통하여 일어남을 규명하였다. 또한 GPR119 리간드는 강력한 증식 인자인 platelet derived growth factor (PDGF)에 의한 성상세포의 증식을 감소시켰다. 나아가 PDGF에 의하여 증가되는 증식 유도 인자인 peptidyl prolyl isomerase (Pin1)의 발현이 GPR119 리간드에 의하여 감소함을 확인하였고, TGFbeta에 의하여 증가된 간 섬유화 유도 인자에 대한 GPR119 리간드의 억제 효과가 부분적으로 Pin1을 매개하여 나타나는 효과임을 확인하였다. GPR119에 의하여 그 발현이 조절되는 Pin1은 이소머라제의 한 종류로서 만성 염증 질환 및 폐 섬유화증 (pulmonary fibrosis)에 관여하고, 암세포의 증식 및 전이를 유도한다고 알려져 있다. 하지만 간 섬유화증 조절에 있어 Pin1의 역할 및 그 분자적 기전에 대한 연구는 수행되지 않았다. 본 연구에서는 면역염색법 및 immunoblot를 통하여 간암 환자의 간 조직 중 섬유화 발생 부위 및 성상세포에서 Pin1의 발현이 증가함을 확인하였고, Pin1이 간 성상세포의 활성화 과정에 미치는 영향을 연구하였다. 섬유화 발생 시 성상세포에서 Pin1의 발현이 증가하는 점에 착안하여 성상세포에 adenovirsus를 이용하여 Pin1을 과발현 시킨 결과, 성상세포의 근섬유모세포 분화 시 증가 하는 alpha-SMA 발현이 증가하였다. 이와 반대로, Pin1 저해제 및 Pin1 short hairpin RNA (shRNA)을 이용한 Pin1 억제 시 alpha-SMA의 발현이 감소하였다. 이는 간 섬유화 진행 시 Pin1이 성상세포의 활성화 과정에 관여함을 시사한다. 또한 세포 외 기질 및 교원질을 축적시키는 핵심 인자인 TGFbeta1 mRNA의 발현이 Pin1을 과발현 시킨 성상세포에서 증가함을 관찰하였다. 이와 반대로, Pin1 결손형 마우스 배아 섬유모세포 및 Pin1 저해제를 처리한 성상세포에서는 TGFbeta1 mRNA의 발현이 감소하였다. 또한, reporter gene 분석 및 siRNA 도입을 통하여 Pin1의 TGFbeta1 유전자 전사 조절 과정에서 c-Jun/activator protein-1 (AP-1)이 중요 전사인자로 작용함을 규명하였다. 나아가 Pin1 저해제 및 Pin1 shRNA를 통한 Pin1 억제 및 Pin1 결손형 마우스 배아섬유모세포에서 TGFbeta1에 의해 유도되는 Smad2/Smad3의 인산화 및 하위조절 단백질인 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)의 발현 증가가 감소됨을 관찰하였다. 종합할 때, 본 연구에서는 GPR119가 간세포 및 간 성상세포에 발현되어 있음을 밝혔고, GPR119 리간드에 의하여 간세포의 지질 축적 억제 및 성상세포의 활성화에 의하여 야기되는 교원질의 축적을 억제시킬 수 있음을 규명하였다. 또한 GPR119에 의하여 조절되는 Pin1이 간 성상세포의 활성화 및 TGFbeta1 유전자 발현 조절에 관여함을 규명하였다. 이는 GPR119 가 비알코올성 지방간 질환 중 지방간 및 간 섬유화증에 대한 신규 약물 표적분자로서 효과적인 약물 작용점이 될 수 있음을 제시한다.