Studies on the control of p53 mediated cell-cycle arrest by hnRNP-K sumoylation in response to DNA damage

Abstract

P53은 세포의 삶과 죽음에 관련된 다양한 신호전달 과정에 관여한다. P53은 전사인자로써 세포 손상시 다양한 표적 유전자의 발현을 조절하고 동시에 세포 주기 중지, DNA 복구 그리고 세포 사멸과 같은 다양한 반응을 유도한다. DNA 손상에 반응하여 활성화된 p53은 결과적으로 G1/S 혹은 G2/M 시기의 세포 주기 정지를 유도하는데, G1/S 시기의 정지는 cyclin 의존적 활성효소 억제인자인 p21에 의해서 주요하게 유도된다. Small Ubiquitin-related modifier (SUMO, 수모)는 유비퀴틴 유사 단백질로써 다양한 세포내 단백질에 결합한다. 수모는 유비퀴틴과 마찬가지로 E1 활성효소 (SAE1/SAE2), E2 접합효소 (Ubc9), E3 결합효소 (PIASs)에 의한 연쇄 반응 효소 작용에 의해 표적 단백질에 결합한다. 결합된 수모는 수모 특이적 단백질 분해효소에 의해 제거된다. 이런 가역적 수모화는 전사과정, 핵내 이동과정, 신호전달체계와 같은 다양한 세포내 과정을 조절할 수 있다. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-K (hnRNP-K)는 RNA 결합 단백질로써 염색질 재형성, 전사과정, mRNA 스플라이싱, 번역과정과 같은 다양한 세포내 과정과 연관되어 있다. hnRNP-K는 정상적인 상태에서는 HDM2에 의해서 유비퀴틴화되어 proteosome에 의해 분해된다. 그러나 세포내에 DNA 손상이 일어나면 hnRNP-K는 안정화되고 p53의 전사 활성 인자로 작용하여 세포 주기 정지를 일으킨다. 그러나 어떻게 hnRNP-K의 안정화와 그 기능이 조절되는지는 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 UV에 의해 hnRNP-K의 수모화가 유도되고, 이는 유비퀴틴화를 억제하여 hnRNP-K가 안정화됨을 밝히었다. UV 처리 후 6시간이 되면 hnRNP-K의 수모화는 현저하게 증가하고 이는 18시간만에 다시 감소하는데 이런 변화는 hnRNP-K 자체의 발현 정도와 같은 패턴으로 나타난다. 그러나 hnRNP-K의 유비퀴틴화는 UV 처리 후 6시간때에 감소했다가 다시 처음 상태로 증가한다. 이는 hnRNP-K의 수모화와 유비퀴틴화가 서로 반대적으로 관련이 있다고 할 수 있으며 결과적으로 hnRNP-K의 수모화는 자체의 안정화를 유도한다고 할 수 있겠다. 또한 IR이나 doxorubicin에 의한 다른 종류의 DNA 손상이 일어나는 상태에서도 hnRNP-K의 수모화가 유도됨을 확인함으로써, hnRNP-K의 수모화에 의한 안정화는 DNA 손상에 따라 나타나는 일반적인 반응이라 할 수 있겠다. 수모화가 되지 않는 돌연변이체와 수모화가 되어 있는 hnRNP-K 단백질을 이용하여 비교한 결과, hnRNP-K의 수모화는 HDM2와의 결합을 떨어뜨리고 p53과의 결합을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 수모화된 hnRNP-K는 p53과 우선적으로 결합하는 반면, 수모화 되지 않은 hnRNP-K는 HDM2와 더 결합한다. 이처럼 hnRNP-K의 수모화는 p53이나 HDM2와의 결합에 있어서 스위치 역할을 할 수 있다. 게다가 UV에 의해 유도되는 hnRNP-K의 수모화는 p53의 전사활성능력을 증가시켜 p21의 발현을 높임으로써 세포 주기 정지를 유도한다. 이는 수모화가 되지 않는 돌연변이체와는 달리 수모화가 될 수 있는 hnRNP-K는 UV에 의해 p21의 프로모터에 동원되는 결과와 일치한다. 결론적으로 hnRNP-K의 수모화는 자체의 안정화를 증가시킬 뿐만 아니라 p53의 전사활성능력 또한 증진시킬 수 있다. PIAS3는 ATR 의존적 경향으로 hnRNP-K의 수모 E3 결합 효소로써 작용한다. 그러나 수모 특이적 단백질 분해효소인 SENP2는 UV 처리후 늦은 시기에 hnRNP-K로부터 수모를 제거하고 이는 hnRNP-K의 불안정화를 가져옴으로써 세포 주기 정지로부터 빠져나오게 한다. UV 처리 후 hnRNP-K의 수모화와 안정화가 증가했다가 감소하는 것과 마찬가지로 hnRNP-K와 PIAS3간의 결합 역시 UV 처리 후 같은 시간대에서 증가했다가 감소하며 이는 SENP2와의 결합 정도와 반대 경향으로 나타난다. 결과적으로, PIAS3와 SENP2는 UV 처리 이후 hnRNP-K의 수모화와 안정화를 시간 과정별로 서로 상반되게 조절한다. 면역 세포 화학 분석에 의하면 수모화는 hnRNP-K의 핵내로의 위치 결정에 관여한다. 정상적인 hnRNP-K는 UV에 의해 오로지 핵에만 위치하지만 수모화가 되지 않는 돌연변이체의 경우 40% 정도가 UV 처리에도 불구하고 여전히 핵과 세포질에 위치한다. 게다가 PIAS3의 감소나 SENP2의 과다발현은 UV에 의한 과다발현된 hnRNP-K의 핵내 위치를 저해한다. 그러나 세포내 hnRNP-K의 핵내 위치의 경우, UV 처리나 PIAS3 감소가 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 보아 수모화는 hnRNP-K의 핵내 위치에 보조적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 요약하여 DNA의 손상에 의해 유도되는 hnRNP-K의 수모화는 p53에 의해 야기되는 세포 주기 정지 조절에 중요한 역할을 한다.