다양한 생물 유래 타이로시나아제에 관한 연구: 다당류-단백질 간의 가교 및 카테콜형 물질의 생산

Abstract

타이로시나아제는 산소를 추가적으로 사용하여 두 번의 연속적인 산화반응을 촉매하며, 이는 모노페놀 물질의 오르토 위치에 수산화기를 도입하여 카테콜형 물질로 전환 시키는 첫 번째 반응과 카테콜형 물질을 퀴논형 물질로 한 번 더 산화시키는 두 번째 반응을 포함한다. 첫 번째 산화반응을 통해 생리활성이 뛰어난 카테콜형 물질을 생산하거나, 첫 번째 및 두 번째 반응을 모두 이용하여 고분자 사슬 간의 가교를 유도하는 등 타이로시나아제를 이용하여 다양한 연구가 진행되고 있다. 본 논문은 타이로시나아제를 이용하여 히알루론산과 젤라틴 기반의 생체 모방 하이드로젤을 만드는 연구와 플로레틴에 기질특이성을 가지는 타이로시나아제를 클로닝하여 구조적 차이를 확인하는 연구를 골자로 하고 있다. 첫 번째로 천연고분자를 이용하여 하이드로젤 스캐폴드를 형성하기 위해 타이로시나아제와 페록시다아제, 락카아제를 가교제로 사용하여 비교하였고, 그 중 타이로시나아제를 사용한 경우 가장 기계적 물성이 향상된 것을 확인하였다. 이 후 세 가지 생물 유래 타이로시나아제를 히알루론산과 젤라틴 가교를 위해 처리했을 때, Bacillus 유래, Agaricus(버섯) 유래 타이로시나아제에 비해 Streptomyces 유래 타이로시나아제에 의해 가교 밀도 및 기계적 강도가 높은 하이드로젤이 형성됨을 확인하였다. 생체적합성 확인을 위해 만들어진 젤에 C2C12 세포를 배양하여 Live/Dead assay 및 immunostaining을 진행하였다. 마지막으로 코아세르베이션을 이용하여 젤 용액의 점도를 낮춰주었고 이를 통해 분사 가능한 하이드로젤을 만들 수 있었다. 두 번째로 다양한 생물 유래 타이로시나아제를 수집하여 여러 기질에 대한 라이브러리를 구축하고자 연구를 수행하였고, 먼저 1,300 여개의 박테리아 유래 타이로시나아제 아미노산 서열을 수집하여 계통수(phylogenic tree)를 그리고 잘 규명되어진 B. megaterium 유래(BM_Ty), S. avermitilis 유래 타이로시나아제(SA_Ty)와 유사성이 50% 이하로 낮은 타이로시나아제를 선별하였다. 그 중 B. thailandensis E264 유래 타이로시나아제(BT_Ty)를 우선적으로 E. coli에서 발현하여 기질특이성을 비교한 결과 L-타이로신과 플로레틴 같은 방향족 링의 개수가 2개 이하로 적고 flexible한 구조를 가지는 물질에 대한 기질특이성을 확인하였다. homology 모델링을 통해 BT_Ty의 구조를 예측하고 BM_Ty, SA_Ty와 비교한 결과 활성부위 입구 주변에 존재하는 여러 개의 루프에 의해 기질 특이성이 좁아졌음을 예측할 수 있었다. 또한 플로레틴으로부터 생산된 3-하이드록시 플로레틴의 반응 수율을 향상시키기 위해 환원력을 제공하는 L-아스코르브산 및 Borate 완충용액을 사용하였고, 반응 시작 9시간 후 약 100% 수율로 3-하이드록시 플로레틴을 생산할 수 있었다.