Role of cell wall-associated virulence factors of staphylococcus aureus in biofilm formation and induction of inflammatory responses

Abstract

목 적 황색포도상구균은 통성혐기성 그람양성세균으로 사람의 피부 또는 점막에 집락을 형성하고높은 보균율을 가지고 있으며 인체 내 가벼운 피부염증에서부터 패혈증, 폐렴, 심내막염 등과 같은 중증 질환까지 유발하는 치명적인 병원균이다. 특히 황색포도상구균은 세균 최 외곽에 존재하는 세포벽 병독성인자를 통해 강한 면역반응을 일으켜 비정상적인 염증반응을 유도하고 바이오필름 형성을 통해 감염 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 하지만 현재까지 이에 대한 핵심 세포벽 병독성인자 규명 및 작용기전에 대한 연구는 매우 미비한 상태이다. 황색포도상구균에 의한 감염과 감염질환을 예방하고 치료하기 위해서는 세균 감염기전에 대한 이해가 필요하며 이를 바탕으로 한 조절물질 개발 연구가 이루어져야 한다. 따라서 본 연구에서는 황색포도상구균에 의해 유도된 면역반응 및 바이오필름을 매개하는 주요 세포벽 병독성인자 발굴 및 작용기전을 규명하고 이를 조절할 수 있는 물질개발 및 조절 기전을 규명하고자 하였다.

실험방법 황색포도상구균 세포벽 병독성인자들의 선천성 면역활성 능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포 (마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포, C57BL/6 정상마우스 또는 TLR2-, NOD2 결손마우스의 골수유래 대식세포) 또는 인체 대식세포 (인체 단핵구유래 대식세포)를 황색포도상구균 정상균주, 지질단백질 결여균주, 리포테이코익산 결여균주 또는 정제된 지질단백질, 리포테이코익산 및 펩티도글리칸, 펩티도글리칸 소단위체 (MDP, Tri-DAP, M-tri DAP) 물질로 자극한 뒤 생성된 염증매개인자들을 측정 후 비교 분석하였다. 황색포도상구균 세포벽 병독성인자의 염증매개인자 생성 유도능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포에 황색포도상구균 정상균주, 지질단백질 결여균주, 리포테이코익산 결여균주를 처리한 후 nitric oxide (NO)의 생성을 Griess시약을 이용한 아질산염 측정법울 통하여 확인하였고 inducible NO synthase (iNOS)의 생성을 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 확인하였다. 리포테이코익산과 MDP의 염증매개인자 생성 유도능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포와 인체 대식세포에 리포테이코익산과 MDP를 단독 또는 병용처리 후 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2, PGE2)의 생성을 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통하여 확인하였고 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 생성을 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 확인하였다. 리포테이코익산과 MDP의 염증매개인자 발현관련 전사인자 활성 능력을 평가하기 위해 마우스 대식세포에 리포테이코익산과 MDP를 단독 또는 병용처리 후 NF-κB, AP-1, CRE의 활성을 루시퍼라아제(발광효소) 리포터 유전자 분석기법을 통해 확인하였다. 세포벽 병독성인자들에 의한 톨유사수용체(Toll-like receptor, TLR)의 신호전달 활성을 조사하기 위해 TLR2 또는 TLR4 의존적인 전사활성에 따라 세포막에 분화항원(Cluster of differentiation, CD) 25를 발현하도록 유전적으로 조작된 중국 햄스터 난소(Chinse hamster ovary cell, CHO)/CD14/TLR2 세포주와 CHO/CD14/TLR4 세포에 황색포도상구균 정상균주, 지질단백질 결여균주, 리포테이코익산 결여균주를 처리한 후 유세포 분석기를 이용하여 CD25 발현을 분석하였다. 황색포도상구균 바이오필름에 대한 세포벽 병독성인자들의 영향을 조사하기 위해 황색포도상구균에 정제된 리포테이코익산, 지질단백질, 펩티도글리칸을 처리한 후 형성된 바이오필름을 crystal violet 염색법, 공초점현미경, 주사전자현미경을 통해 확인하였다. 황색포도상구균의 쿼럼센싱 물질 생성에 대한 리포테이코익산의 영향을 조사하기 위해 황색포도상구균에 리포테이코익산을 처리한 후 생성된 autoindcuer-2 (AI-2)을 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) BB170 균주를 이용한 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석기법 통해 확인하였다.

결 과 황색포도상구균 지질단백질 결여균주는 대식세포에서 정상균주와 리포테이코익산 결여균주에 비해 NO와 NO 합성 효소인 iNOS의 생성을 유도하지 못하였다. 또한 정상균주와 리포테이코익산 결여균주는 iNOS 생성에 관여하는 전사인자인 NF-κB와 STAT-1의 활성을 유의적으로 증가시켰지만 지질단백질 결여균주는 이들의 활성화를 유도하지 못하였다. 특히 정상균주와 리포테이코익산 결여균주는 TLR2의 활성을 농도 의존적으로 증가시켰지만 지질단백질 결여균주의 자극은 TLR2 활성에 아무런 영향을 주지 못하였다. 따라서 지질단백질은 황색포도상구균에 의한 TLR2 활성과 이로 인한 iNOS 발현 및 NO 생성에 관여하는 핵심 세포벽 병독성인자임을 확인하였다. 정제된 황색포도상구균 리포테이코익산과 펩티도글리칸은 대식세포에서 상승효과를 보이며 COX-2와 PGE2 생성을 유도하였다. 특히 펩티도글리칸의 소단위체 물질들 중 MDP가 리포테이코익산과 COX-2 발현에 상승효과를 보이는 것을 확인하였다. 하지만 리포테이코익산과 MDP의 COX-2 발현에 대한 상승효과는 TLR2와 NOD2 결손마우스 대식세포에서 실험 시 사라졌다. 리포테이코익산과 MDP는 COX-2 발현 관련 전사인자인 NF-κB와 CRE 활성에도 상승효과를 보였다. 따라서 리포테이코익산은 펩티도클리칸의 소단위체 물질인 MDP와 협력하여 황색포도상구균에 의한 염증반응에 관여하는 것을 확인하였다. 분비된 황색포도상구균 리포테이코익산을 포함하고 있는 정상세균의 배양액은 황색포도상구균의 바이오필름을 억제하였지만 리포테이코익산 결여균주의 배양액은 바이오필름을 억제하지 못하였다. 정제된 황색포도상구균 리포테이코익산 역시 바이오필름을 억제하였고 지질단백질은 아무런 영향을 주지 못하였다. 다양한 그람양성세균들에서 정제한 리포테이코익산 모두 황색포도상구균의 바이오필름을 억제하였고 이 중 특히 유산균 Lactobacillus plantarum에서 정제된 리포테이코익산이 매우 큰 억제효과를 보였다. L. plantarum 리포테이코익산은 황색포도상구균 바이오필름에 핵심 구성물질인 poly-N-acetylglucosamine의 생성을 억제하였고 바이오필름의 음성 조절물질로 알려진 AI-2의 생성을 증가시킴으로써 황색포도상구균 바이오필름을 억제하였다. 또한 리포테이코익산의 D-alanine 잔기가 바이오필름 억제 효과에 필수적으로 작용하는 것을 확인하였다

결 론 이상의 연구결과들로부터 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 지질단백질은 황색포도상구균에 의한 염증반응에 관여하는 핵심 세포벽 병독성인자이며 리포테이코익산은 MDP와 협력하여 황색포도상구균에 의한 염증반응에 기여한다. 또한 리포테이코익산은 황색포도상구균 바이오필름에 대한 음성조절인자로 작용하며 특히 L. plantarum 리포테이코익산은 황색포도상구균에 의한 염증질환을 예방 및 치료 할 수 있는 항바이오필름 작용제로 활용될 수 있다.