Identification of dSETDB1-interacting proteins in Drosophila Ovarian Somatic Cells

Abstract

Eggless라고 불리는 초파리 SETDB1 단백질은 히스톤 3의 9번째 리신의 트리메틸화를 시켜 염색질의 억제된 상태를 유지시키는 역할을 한다. 흥미롭게도 이 과정은 PIWI와 상호작용하는 소형 리보핵산의 전사와 발생을 활성화하고 이는 초파리의 난자형성 과정 중 난소의 생식세포와 체세포에서 각기 다른 방법으로 다른 집단에서 발생된 전이인자의 수준을 억제시킨다. dSETDB1에 의한 전이인자 억제는 다음 세대로 넘어가게 될 유전자의 온전함을 지키는데 없어서는 안될 후성유전학적 필수 요소이며, 따라서 dSETDB1이 기능하는 구체적인 방법과 상호작용하는 인자들을 발굴하고 그 인자들의 역할과 그 역할이dSETDB1에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 dSETDB1에 대한 다클론성항체를 제작하여 초파리 난소 체세포 세포주에서 내생 하는 dSETDB1을 확인하고 과발현된 Flag-dSETDB1이 핵 안에 위치하는 것을 확인한 후 면역침강을 통해 dSETDB1과 SUMO 의존적 혹은 비의존적으로 상호작용 할 가능성이 있는 두 개의 후보를 질량분석법을 통해 도출해내었다. 두 후보인 PEP와 hnRNP K가 억제된 세포에서 전이인자의 증가 정도가 dSETDB1이 억제된 세포와 비슷한 양상을 보였고 수모화를 와해시키는 Ulp 단백질 발현이 억제된 세포에서도 비슷한 양상을 보이는 것으로 보아 이들이 dSETDB1 이 메틸전달효소로써 piRNA 발생을 촉진하고 전이인자의 활성을 억제하여 후성유전학적 역할을 수행할 수 있도록 도와주는 역할을 하는 것으로 사려된다.

Drosophila SETDB1, so called Eggless, is a methyltransferase which deposits trimethylation on 9th lysine residue of histone 3 to maintain a repressive chromatin state. Repression of transposable elements accomplished by dSETDB1-derived heterochromatin formation is an essential epigenetic process to protect the integrity of genome for future progenies. Therefore discovering sophisticated mechanism of epigenetic control of dSETDB1 and the effect of its interacting factors to the function of dSETDB1 is undoubtedly important. In this study, polyclonal dSETDB1 antibody was attained from rabbits injected with partial dSETDB1 and was used to confirm endogenous dSETDB1 in Drosophila OSC cells. We confirmed nucleus localization of overexpressed Flag-dSETDB1 in OSC cell and acquired two candidates – PEP, hnRNP K – that might interact with dSETDB1 in SUMO-dependent or independent manner through Flag-dSETDB1 immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis. PEP and hnRNP K knockdown cells show similar trend in level of transposable elements compared to dSETDB1 as well as SUMO de-conjugating enzyme, Ulp. Therefore our study implies discovery of novel dSETDB1-interacting proteins, PEP and hnRNP K, which contribute to the function of dSETDB1 as a methyltransferase to trigger piRNA biogenesis and transposon silencing.