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Antiviral Activity of Constituents Identified in Propolis against Human Rhinovirus and their Possible Mode of Action

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Authors
권민정
Advisor
안용준
Major
농업생명과학대학 농생명공학부(바이오모듈레이션전공)
Issue Date
2013-02
Publisher
서울대학교 대학원
Description
학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 농생명공학부(바이오모듈레이션전공), 2013. 2. 안용준.
Abstract
Human rhinovirus (HRV)는 감기와 같은 상부호흡기 질병에서 가장 큰 요인을 차지하는 바이러스로 감기 원인 바이러스 중 30-50%를 차지한다. 하부호흡기에 감염될 경우 폐렴, 급성 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 천명 등을 일으키기도 해 그 심각성은 상당하다 할 수 있다. 더욱이 HRV의 100여 가지 혈청형(serotypes)은 백신 및 치료제 등의 개발을 어렵게 해 효과적인 감기약은 현재로선 전무한 실정이다. 시판되는 감기약의 대부분은 증상을 완화시키는 수준에 그쳐 이에 따른 약물의 오남용 및 항생제 저항성 등의 문제가 대두되고 있으며 감기환자의 결석, 결근, 치료비용 등 HRV 유발 질병의 사회적 비용 또한 상당하다. 이에 안전하고 다양한 혈청형에 효과를 보이는 감기 치료제를 찾고자 하는 노력이 더욱 커지고 있다. 본 연구에서는 항 HRV 활성을 보이는 여러 천연물 중 양봉산물의 하나인 프로폴리스 및 그 구성물질의 항바이러스성을 탐색하고 작용 기작을 규명하고자 하는 실험을 수행하였다.
실험에 이용된 Sulforhodamine B 검정법의 기주 세포로써 HeLa cell을 사용하였고 HRV-2, -3, -4, 세 가지 혈청형을 적용하여 넓은 범위의 혈청형에 효과를 보이는 프로폴리스 조성물을 찾고자 하였다. 브라질산 프로폴리스를 선정하여 용매별 순차 분획을 통해 클로로포름층, 에틸아세테이트 층에서 HRV에 대한 높은 항바이러스성을 확인하였고 이후 다양한 크로마토그래픽 방법을 사용하여 분리하였다. 클로로포름 층에서 분리한 kaempferol (CC50, 65.0
IC50, 3.7
TI, 17.57) 은 시판되는 항바이러스제인 ribavirin (CC50, > 100
IC50, 74.7
TI, > 1.3)에 비해 높은 세포독성을 보였으나 HRV 혈청형 3에 대해 훨씬 뛰어난 활성을 보였다. 또한 에틸아세테이트 층에서 분리, 동정한 (E)-ρ-coumaric acid (CC50, > 100
IC50, 74.6
TI, > 1.3)는 ribavirin과 비슷한 수준의 활성을 HRV 혈청형 3에 보였다. 혈청형 2, 4에 대해서도 검정한 결과 두 물질의 활성에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. (E)-ρ-coumaric acid와 kaempferol의 작용 기작을 규명하기 위한 실험을 수행한 결과 두 물질 모두 HRV 입자의 전염성에는 영향을 끼치지 않으며 (E)-ρ-coumaric acid의 경우 바이러스 접종과 동시에 처리한 경우에만 항바이러스성을 나타내고 접종 전이나 접종 후에는 활성이 50%이하로 떨어지는 것을 확인하였다. Kaempferol은 바이러스 접종 후 6시간까지 50% 이상의 효과를 보이는 것으로 나타났다. 또한 Real-time RT-PCR을 통해 두 분리물질이 모두 바이러스 복제를 억제하며 라이노바이러스 수용체 (ICAM-1)와 염증성 시토카인(IL-6) mRNA 발현을 억제하는 것을 검증하였다. 기존에 알려진 프로폴리스 구성 물질 12개에 대해 HRV-3 검정을 실행한 결과, chrysin, quercetin, acacetin, luteolin이 4.1-5.8 μg mL−1 범위의 활성을 보였다. Caffeic acid, protocatechuic acid, fisetin, galangin, ferulic acid 등도 (9.4-48.3 μg mL−1) ribavirin에 비해 높은 효과를 보였다. Quercetin, chrysin, caffeic acid, protocatechuic acid 중에서 protocatechuic acid만이 바이러스 입자와 상호작용하여 감염성을 저하시키는 것으로 나타났다.
이상의 결과를 바탕으로 본 논문의 연구는 브라질산 프로폴리스에 함유된 활성본체를 밝혀냈다는데 그 의의가 있고, 구성 물질에 대한 생물검정과 작용 기작 규명을 통해 항바이러스제로써 가능성을 탐색하고 프로폴리스의 새로운 생리활성을 밝혀내어 농업적, 산업적으로 그 활용 가능성이 높다고 판단되며 추가적 연구가 요구된다.
HRV is the most frequent causative agents of mild upper respiratory tract infections, including common colds, and accounts for about 30-50% of all cases. They are usually a self-limited illness confined to the upper respiratory tract. However, HRV can also infect the lower respiratory tract symptoms, such as pneumonia and wheezing in children and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in adults. There have been difficulties to provide efficient treatments or vaccination because of over 100 serotypes. Current common cold medicine on sale is only efficient to reduce the symptoms. Accordingly, drug misuse and abuse has been raised and antihistamines and antibiotics usages have caused many side effects. Its socio-economic importance in terms of employee absenteeism, physician visits, and medication costs are also considerable. Therefore, safe and bioactive on diverse serotype treatments development are demanded significantly for anti-HRV agents. This study aimed to investigate antiviral activity of propolis involved in bee products and its constituents and elucidate their possible mode of action.
An assessment was made of the cytotoxic and antiviral activity of the propolis and another previously known propolis constituents toward HeLa cell (ATCC CCL–2) and three HRV serotypes (HRV-2 ATCC VR-1112AS/GP, HRV-3 ATCC VR-1113, and HRV-4 ATCC VR–1114AS/GP), respectively, using a Sulforhodamine B bioassay. The Brazilian ethanolic extract was sequentially partitioned into different organic solvents and chloroform soluble fraction and ethyl acetate soluble fraction showed remarkable antiviral activities. Respective fractions were separated and identified by various chromatographic techniques. Kaempferol (CC50, 65.0
TI, 17.57) from chloroform soluble fraction showed significantly high antiviral activity compared with currently used antiviral agents with broad spectrum, ribavirin (CC50, > 100
TI, > 1.3), even with high cytotoxicity. (E)-p-coumaric acid (CC50, > 100
TI, > 1.3) from ethyl acetate soluble fraction and ribavirin did not differ significantly in the antiviral activity from each other. As the result of investigation on possible mode of action, kaempferol and (E)-p-coumaric acid did not alter the infectivity of virus particles (HRV-3). Time-course addition experiments of two constituents were also carried out. 10 μg/mL kaempferol affects the initial stage of HRV infections (0-6 h) and 100 μg/mL (E)-p-coumaric acid showed its antiviral activity when added just after the virus inoculation and very early stage after the virus inoculation (0-1 h). Inhibition of RNA replication levels of HRV-3 was investigated by real-time RT PCR. At the presence of kaempferol and (E)-p-coumaric acid, the RNA replication levels of HRV were reduced. Also expression of RNA levels of rhinovirus receptors (ICAM-1) and inflammatory cytokines (IL-6) were inhibited by two constituents. As the result of antiviral activity of previously known propolis constituents, High antiviral activity was also observed with chrysin, quercetin, acacetin, luteoloin (4.1-5.8 μg mL−1). Caffeic acid, protocatechuic acid, fisetin, galangin, and ferulic acid showed moderate antiviral activity compared with ribaivrin (9.4-48.3 μg mL−1). Among the quercetin, chrysin, caffeic acid, and protocatechuic acid, only protocatechuic acid decreased the virus infectivity through interaction with virus particles.
In conclusion, global efforts to reduce the level of antibiotics justify further studies on propolis-derived materials containing the compounds described as potential antiviral products or lead molecules for the prevention or eradcation from humans from diseases by HRV.
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/126038
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Appears in Collections:
College of Agriculture and Life Sciences (농업생명과학대학)Dept. of Agricultural Biotechnology (농생명공학부)Biomodulation (바이오모듈레이션전공)Theses (Master's Degree_바이오모듈레이션전공)
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