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쥐의 혈액암 세포에서의 30Kc19 단백질과 절단가능한 링커를 이용한 아스파라기나아제의 활성 강화

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dc.contributor.advisor박태현-
dc.contributor.author양성재-
dc.date.accessioned2017-07-19T05:58:10Z-
dc.date.available2017-07-19T05:58:10Z-
dc.date.issued2016-08-
dc.identifier.other000000136256-
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/10371/129425-
dc.description학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 화학생물공학부, 2016. 8. 박태현.-
dc.description.abstractL-asparaginase (ASNase)는 널리 쓰이는 급성 림프구성 백혈병 (Acute Lymphoblast Leukemia (ALL))의 단백질 치료제로 알려져 있다. 급성 림프구성 백혈병은 주로 2~5세 소아에게서 많이 발병하고 항암제를 정맥주사하여 치료하는 완전 관해 유도 치료방법이 있다. 하지만 소아의 경우 80%, 연령이 높아질수록 치료율이 낮아지며 60세 이상의 성인의 경우 10% 미만이 완치에 도달한다. 완전 관해 유도 요법의 치료제 중 L-asparaginase가 이용되는데 E.coli와 같은 외래종 유래의 단백질이기 때문에 과민성 쇼크가 일어나기도 하고 약물의 반감기가 짧아 격일 단위로 투여해야 하는 단점이 있다.
본 연구에서는 세포를 투과하고 효소를 안정화 시키는 특성이 있는 Bombyx mori 유래의 30Kc19 단백질을 L-asparaginase와 conjugation 하였다. 또한 암세포의 protease인 MMP-2 cleavable linker를 두 단백질 사이에 삽입하여 암세포에서 선택적으로 cleavage되게 하였다. 또한 두 단백질 사이의 물리적 거리를 둠으로써 효소의 steric hindrance를 줄이고 활성을 증가시켰다. 이를 위해 L-asparaginase-Cleavable linker-30Kc19 fusion protein을 대장균에서 생산한 후 정제를 진행했고 L-asparaginase의 효소 활성 강화효과와 fusion protein의 세포 침투성을 확인하였다. 또한 쥐의 혈액암 세포 L5178Y에서 cleavable linker가 있는 fusion protein이 cleavable linker가 없는 fusion protein보다 용량대비 10~100배 가량 효율적임을 확인하였다.
본 연구로 cleavable linker가 달린 fusion protein이 cleavable linker가 없는 fusion protein보다 효율적으로 암세포 치료에 이용될 수 있음을 입증하였고 향후 추가적인 In vivo 실험과 pegylation과 같은 modification을 통해 실제 백혈병 환자에게도 사용될 수 있을 것이라는 가능성을 제시하고 있다.
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dc.description.tableofcontents1. 서론 8
1.1. L-asparaginase (ASNase)에 대한 선행 연구 8
1.1.1. Acute lymphoblastic leukemia의 특징과 E. coli 유래의 L-asparaginase 8
1.1.2. E. coli 유래의 ASNase의 문제점과 해결책 9
1.2. 30Kc19 단백질에 대한 선행 연구 11
1.2.1. 누에 체액에서 30Kc19 단백질의 발견 11
1.2.2. 30Kc19 단백질의 특성 12
1.2.3. 30Kc19 단백질의 세포투과성 12
1.2.4. 30Kc19 단백질의 효소 안정화 13
1.3. Linker 14
1.3.1. Linker의 특징 14

2. 실험 재료 및 방법 15
2.1. Plasmid 제작 (pET23a/ ASNase-PLGLAG-30Kc19) 15
2.2. ASNase-PLGLAG-30Kc19, ASNase-30Kc19 단백질의 발현 및 정제 17
2.3. MMP-2 Cleavage assay 18
2.4. Enzyme Activity Assay 19
2.5. RT-PCR 20
2.6. CCK-8 Assay를 통한 ASNase-PLGLAG-30Kc19 단백질의 세포 내 독성 검사 22
2.7. CCK-8 Assay를 통한 ASNase-30Kc19, ASNase-PLGLAG-30Kc19 단백질의 L5178Y cell line 독성 비교 22
2.8. Immunocytochemistry (Confocal Laser Scanning Micrscope, CLSM) 23

3. 결과 및 고찰 24
3.1. Fusion protein의 크기 및 농도 확인 24
3.2. In vitro MMP-2 cleavage assay 26
3.3. Direct nesslerization을 통한 효소 활성 측정 28
3.4. RT-PCR을 통한 MMP 발현 확인 30
3.5. ASNase-LK-30Kc19 단백질의 세포 투과성 32
3.6. ASNase-30Kc19, ASNase-LK-30Kc19 단백질의 L5178Y cell line에서의 독성 34
3.7. ASNase-LK-30Kc19 단백질의 FDC-P1, L5178Y cell line에서의 독성 비교 36

4. 결론 38

5. 참고문헌 40

Abstract 46
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dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent699733 bytes-
dc.format.mediumapplication/pdf-
dc.language.isoko-
dc.publisher서울대학교 대학원-
dc.subject백혈병-
dc.subject완전관해유도요법-
dc.subject30Kc19-
dc.subjectL-asparaginase-
dc.subjectcleavable linker-
dc.subject.ddc660-
dc.title쥐의 혈액암 세포에서의 30Kc19 단백질과 절단가능한 링커를 이용한 아스파라기나아제의 활성 강화-
dc.typeThesis-
dc.description.degreeMaster-
dc.citation.pages47-
dc.contributor.affiliation공과대학 화학생물공학부-
dc.date.awarded2016-08-
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