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인간 BCRP를 발현시킨 MDCK cell line의 구축과 그 모델의 응용에 관한 연구
Expression of human BCRP transporter in MDCK cells and the application of the model

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Authors
이재일
Advisor
정석재
Major
약학대학 약학과
Issue Date
2013-02
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
BCRP약물상호작용스크리닝TransportIC50
Description
학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과, 2013. 2. 정석재.
Abstract
약물상호작용(DDI)의 중요성이 날로 강조되면서 약물수송체 (drug transporter)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한 미국 FDA는 약물상호작용에 큰 영향을 미치는 7가지 주요 약물수송체들을 발표하고 신약허가 과정에서 이들에 대한 약물상호작용 평가 자료를 함께 첨부하도록 지시하고 있다. 따라서 신약개발 과정에서 수송계 수준의 약물상호작용 가능성을 평가할 수 있는 스크리닝 체계의 구축은 매우 시의적절하며 실용적인 의미를 갖는다 할 수 있다. 본 실험에서는 위 중요 수송체 중 하나인 BCRP를 cloning하였으며 그 gene의 기능을 MDCK cell에 안정적으로 발현하는 세포주를 구축하고자 하였다. RT-PCR과 western blot연구를 통해 mRNA와 protein의 존재를 확인하였고 방사활성으로 표지된 기질물질의 수송활성을 평가함으로써 BCRP가 잘 발현되었음을 알 수 있었다. 또한 시중에 상용화 되어있는 8 가지 약물들을 선정하고 이들에 대한 Inhibition screening 연구를 진행하였다. Transport 방식을 이용한 실험에서 rosuvastatin과 pravastatin에서만 sigmoid한 inhibition의 상호작용이 관찰되었으며 이들에 대한IC50값을 계산할 수 있었다. Rosuvastatin과 pravastatin의 IC50값은 각각 9.24 ± 6.40 μM과 1330 ± 865 μM 이였으며 이는 문헌상의 값과 비슷하였으며 보다 낮은 IC50값을 갖는 rosuvastatin이 BCRP와 더 높은 친화력을 갖는 것으로 사료된다. 본 연구에서 구축한 약물수송체 스크리닝 시스템은 신약후보물질에 대한 약물수송계 수준의 약물상호작용 가능성을 개발 초기단계에서 예측할 수 있으며 궁극적으로 신약개발 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대된다.
FDA recently identified seven transport systems, including BCRP (ABCG2), as the transporters that may potentially be related to drug-drug interaction (DDI). While in vitro screening system that expresses the human BCRP is widely available, the availability is limited to only academia and, thus, the practical application (e.g., screening of new chemical entities) has not been possible. Therefore, the objective of the study was to clone and functionally express the efflux transporter in MDCK cells without such limitation. BCRP was cloned and stably expressed in MDCK cells using standard protocols. RT-PCR and western blot were carried out to verify the existence of mRNA and protein in the cell. In addition, the function of the efflux transporter, as expressed by basal to apical transport rate, was determined using radio-labeled substrate. To further study the applicability of the screening system, eight test compounds (rifampicin, rosuvastatin, pravastatin, digoxin, cyclosporin A, cimetidine, cidofovir and clevudine) that are commonly used in the clinic were selected and the function determined. Based on PT-PCR and western blot studies, the mRNA and the protein corresponding to the efflux transporter were readily detected, suggesting that the transporter is expressed. Amongst the eight test compounds, only rosuvastatin and pravastatin were found to interact with the transporter. The IC50 values for rosuvatatin and pravastatin were 9.24 ± 6.40 and 1330 ± 865 μM, respectively, indicating that the kinetic variables were comparable to the literature values. Therefore, BCRP assay system established in this study may be practically useful in predicting DDIs in early phase of drug development.
Language
Korean
URI
http://hdl.handle.net/10371/133458
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Appears in Collections:
College of Pharmacy (약학대학)Dept. of Pharmacy (약학과)Theses (Master's Degree_약학과)
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