인간 OCT2를 발현시킨 Mice를 생성하는데 필요한 Knock-in 벡터 디자인에 관한 연구

Abstract

미국 FDA는 여러 약물 수송체 중 주요 7가지 수송체를 선정하고 신약 개발에서 후보물질의 수송체 수준의 약물상호작용 발생 가능성을 검토하도록 권장하였다. 그러나 인간의 수송체는 기질 특이성, affinity등의 면에서 실험동물의 수송체와 다르기 때문에 in vivo 약물상호작용을 실험동물 수준에서 연구하기는 한계가 있으며 사람에서 약물상호작용가능성을 검토할 경우 엄청난 비용과 시간이 소요된다는 어려움이 있다. 따라서 실험동물의 약물 수송체를 Knock-out한 다음 그 위치에 인간의 약물 수송체를 치환하여 'humanize'한 실험동물 모델은 실용적 의의가 크다 할 것이다. 따라서 본 연구에서는 mouse를 수송체 humanization의 대상으로 상정하고 중요 약물 수송체 중 하나인 oct2를 humanization하기 위한 Knock-in 하는 vector를 설계하고 그 효용성을 평가하고자 하였다. 우선 human kidney total RNA로부터 hOCT2를 cloning하였으며 이를 MDCK cell에 발현시켰다. 여기서 만들어진 세포에서의 수송연구결과 인간의 OCT2 수송체가 잘 기능함을 알았다. 이와는 별도로 mouse Oct2 exon1 중 일부분을 cloning하여 homology arm을 제작하였으며, positive 및 negative selection marker를 cloning하여 Knock-in vector를 필요로 하는 모든 구성요소를 가지는 vector를 제작하였다. 최종적으로 sequencing을 통해서 vector가 온전히 만들어졌음을 확인하였다. Mouse 유래의 CMT-93 cell genome 중 해당위치에 double strand break를 유발한 다음, 제작한 vector를 transfection 시켰다. RT-PCR을 통해 vector가 설계한 대로 homologous recombination에 의해 hOCT2가 발현됨을 확인하였다. 본 연구를 통해 cell이 기원하는 종이 자체적으로 가지고 있는 약물 수송체를 Knock-out시키고 인간의 약물 수송체를 발현시킬 수 있는 vector를 만들 수 있었다. 이를 통해 궁극적으로 약물수송체가 인간의 것으로 치환된 In vivo model을 만들어 약물동력학 연구에 기여할 수 있을 것이다.