MDCK cell에서 human과 rat의 organic anion transporter 3 기능의 종간 차이 연구

Abstract

약물 수송체 (Drug transporter)는 기질이 되는 약물의 흡수, 분포 및 배설 동태에 유의한 영향을 미칠 뿐만 아니라 약물-약물 상호작용 (DDI)에 중요한 역할을 한다는 것이 보고되면서 약물동태학적 특성 평가에서 그 중요성이 최근 지속적으로 강조되어 왔다. 이에 미국의 FDA는 2012년에 약물상호작용 연구에 대한 guidance를 제시했는데, organic anion transporter 3 (이하 OAT3)를 포함한 7가지 중요 transporter를 선정하여 신약개발과정에서 평가할 것을 요구했다. OAT3는 주로 신장의 근위세뇨관에 존재하며 음이온성 약물의 신배설에 영향을 주는데, 음이온성 약물의 체내 동태 예측 및 다른 약물들과의 병용 요법 시에 OAT3에 의한 상호작용이 면밀히 검토될 필요가 있다. 또한 transporter는 종간 차이가 존재한다고 보고되어 있는데, 이 차이가 큰 약물의 경우에 실험동물을 이용한 전임상 연구 결과가 실제 임상 연구 결과와 차이가 있어 예상치 못한 독성, 약물상호작용 등의 문제를 가져올 수 있다. 문헌 보고에서 OAT3의 종간 차이에 대해 언급은 있지만 어떤 약물이 해당하는지 정보가 부족하다. 따라서 본 연구에서는 OAT3의 약물상호작용에 대한 기여도를 in vitro 수준에서 평가할 수 있는 cell line을 구축하고, 구축한 human과 rat OAT3 expressing system을 이용해 OAT3의 종간 차이 정보를 제공하고자 하였다. 먼저 human과 rat form OAT3를 삽입한 vector를 MDCK/FRT cell에 transfection하였다. RT-PCR과 function test를 통해 OAT3가 안정적이고 기능적으로 발현됨을 확인하고, 모델 기질인 estrone-3-sulfate (이하 E3S)에 대한 Km, Vmax 값을 구하였다. 다양한 계열에 속한 22개 약물을 선정하여 구축한 OAT3 expressing system을 이용해 억제성 평가를 수행하고 human과 rat에서의 차이를 보았다. 22개 약물을 각 500 μM로 하여 E3S 1 μM와 동시에 처리했을 때 E3S의 수송을 억제하는 정도를 % uptake로 구하였다. 이 때 human과 rat에서 % uptake가 큰 차이를 보이는 약물에 대해 추가적으로 inhibitory experiment를 수행하여 농도에 따른 % uptake 곡선을 구하고 nonlinear regression analysis로 Ki 값을 구하였다. RT-PCR과 function test를 통해 transfection된 cell이 안정적으로 human과 rat OAT3를 발현한다는 것을 확인하였고, hOAT3 / rOat3 expressing cell은 mock cell에 비해 E3S를 각각 4.59배, 6.64배 높은 수준으로 uptake하였다. 선정한 22개 약물 중, 5개 약물 (cephradine, diphenhydramine, furosemide, rifampicin, theophylline)이 human OAT3와 rat OAT3에서 기질 수송의 억제 수준에 차이를 보였다. 이 차이를 Ki 값으로 측정하였을 때, cephradine과 theophylline은 rOat3의 Ki 값이 hOAT3의 Ki 값보다 더 작았고 furosemide는 hOAT3의 Ki 값이 rOat3의 값보다 더 작았다. 특히 rifampicin은 hOAT3에서는 충분한 억제능을 보이지 않아 Ki 값을 구할 수 없었던 것에 비해 rOat3에서 그 값이 12.9 μM로 비교적 강한 억제능을 보였다. 한편 diphenhydramine은 본 연구에서 Ki 값을 구할 수 없었다. 본 연구에서는 human과 rat OAT3의 종간 차이가 있음을 동일한 cell system을 이용하여 약물의 기질 수송 억제능으로 확인하였고, 보고된 적 없던 5개 약물의 Ki 값을 구함으로써 그 차이를 수치적으로 비교했다는 것에서 의미가 있다. 향후 이 system을 이용한 더 많은 약물 screening을 통해 OAT3 종간 차이에 대한 기초적인 연구 database확보가 가능할 것이다. 이는 약물 개발 과정에서 실험동물로부터 인간 체내 동태를 예측할 때, OAT3의 종간 차이에 의한 예상치 못한 문제 발생을 낮추는 데에 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

Objective. It is now increasingly clear that drug transporters represent crucial determinant in pharmacokinetics. Consistent with this, FDA recently proposed that drug-drug interaction (DDI) be studied for the 7 major transporters for new drugs. It is well known that there are interspecies differences in the function of transporters, which may potentially lead to the specie-difference in the pharmacokinetics (PK) between the animal and human. The purpose of this study is to document the difference in the function of between hOAT3 and rOat3 using in vitro system expressing the anion transporters. Methods. Vectors incorporating human and rat OAT3 were transfected individually in MDCK/FRT cells and their expression / function is confirmed by RT-PCR and function study. In addition, Km and Vmax as measured by the transport of estrone-3-sulfate (E3S

i.e., a standard substrate of the transporter) were determined using nonlinear regression analysis (WinNonlin). Twenty-two drugs encompassing diverse classes were selected and their inhibitory ability on the uptake of E3S is evaluated. Inhibitory experiment was also carried out for the drugs showing significant difference in the inhibition between the function of human and rat OAT3. Results. RT-PCR study showed the transfected MDCK cells stably expressed human and rat OAT3. When E3S was used as the substrate, the uptake were 4.59-fold and 6.64-fold higher in MDCK cells expressing human and rat OAT3, respectively, than that of corresponding control cell. This observation suggests that the stable cell lines are adequate for the function study for the human / rat form of OAT3. Calculated Km and Vmax value were 7.45 ± 0.709 μM, 39.3 ± 1.78 pmol/mg protein/min for hOAT3 and 14.7 ± 4.13 μM, 7.92 ± 1.24 pmol/mg protein/min for rOat3. Amongst the 22 drugs screened, 5 drugs (cephradine, diphenhydramine, furosemide, rifampicin, theophylline) showed significant differences in the inhibition of E3S uptake between hOAT3 and rOat3. To study the specie-difference in the function further, Ki values for hOAT3 and rOat3 were determined for those 5 drugs

It was found that Ki values of rOat3 were lower than those of hOAT3 for cephradine and theophylline, while Ki of hOAT3 was lower than that of rOat3 for furosemide. In particular, we noted that Ki value of rifampicin against rOat3 was 12.9 μM while the inhibition of hOAT3 function could not be measured for rifampicin. Ki value of diphenhydramine was not determined in this study. Conclusion. This study showed that there is specie-difference of OAT3 between human and rat and the extent of the specie-difference was summarized by comparing the respective Ki values. Although similar screening may be necessary for the complete delineation of the underlying mechanism for the specie-difference, the in vitro system expressing the anion transporter from the human and rat form appeared useful in the study of the specie-difference of the function of the organic anion transporter 3.