Phosphodiesterase 4D Inhibition Induces Cell Cycle Arrest and Neural Differentiation via cAMP/PKA Signaling in Primary Glioblastoma Multiforme

Abstract

다형성교아종 (Glioblastoma Multiforme)은 많은 의학적 치료들에 저항성이 있어 성인에서 일년 이하의 생존율을 보이는 가장 잘 알려진 악성 뇌종양이다. 최근 연구 결과들은 교아종의 매우 작은 부분을 차지하는 CD133 양성을 뛰는 암 줄기 세포가 교아종의 시발점임을 보고해오고 있다. 비록, 싸이클릭 AMP 인산디에스테라아제-4 (PDE4) 억제제가 강력한 항암제로 여겨지고는 있지만 인산디에스테라아제-4의 억제가 어떻게 교아종에서 항암적 영향을 조절하는지는 아직 잘 알려져 있지 않다. 그리하여 본 연구에서는 교아종에서 인산디에스테라아제-4 아형 D (PDE4D)의 억제 물질인 CG500354를 조사하고 이 물질의 능력과 세포신호 경로를 밝혔다. CG500354는 p21과 p27의 mRNA 발현을 증가시키는 동시에 싸이클린 B1을 감소시킴에 따라 교아종의 성장을 현저히 감소 시켰다. 면역세포화학 염색에서 또한 성상세포 마커, GFAP와 신경계 마커 Tuj-1의 발현이 증가함과 동시에 신경간세포 마커인 Nestin이 현저히 감소하였다. 인산디에스테라아제-4 아형 D 가 cAMP/PKA 신호 경로에 관여함에 따라 인산화단백질키나아제 A (p-PKA)와 인산화cAMP반응순서결합단백질 (p-CREB)의 단백질 발현 정도를 확인해보았다. 특수 단백질 검출 검사를 통해 CG500354가 면역세포화학 염색 결과처럼 GFAP, Tuj-1의 단백질 발현이 증가하였으며 더 나아가 p-PKA와 p-CREB의 발현 또한 현저히 증가하였다. 위 결과는 cAMP 측정 분석을 통해 다시금 확인되었다. 위의 결과들은 cAMP 측정법을 통하여 확인 및 지지되었으며, 면역세포화학 염색에서도 CG500354가 p53 발현 세포를 증가시켰다. 종합적으로, CG500354는 세포주기, 종양억제 마커 그리고 신경 분화 마커들의 레벨을 증가시킴으로 GBM의 성장 억제를 조절하는 중요한 역할을 한다.

Glioblastoma Multiforme (GBM) is a most common malignant brain tumor in adult with a survival of less than a year due to its resistances. Recent studies have been reported that glioblastoma initiated from CD133 positive subpopulation, known as cancer stem cell population, which takes very small portion in glioblastoma. Although it has been regarded cyclic AMP phosphodiesterase-4 (PDE4) inhibitor as a potent anti-tumor agent, it is still remained unclear how PDE4 inhibition regulates anti-cancer effect in GBM. Thus, in this study, we investigated the novel phosphodiesterase-4 subtype D (PDE4D) inhibitor CG500354 for GBM and determined its ability and cellular signaling pathway in GBM. We found that CG500354 remarkably induced GBM growth arrest by down-regulating cyclin B1 while increasing p21 and p27 mRNA expression. In immunocytochemistry, the expression of Nestin, neural progenitor marker, was decreased in CG500354 treated GBM cells while the expression of GFAP, astrocyte marker, and Tuj-1, neuronal marker, were significantly increased. Regarding PDE4D is involved in cAMP/PKA signaling pathway, we determined the protein levels of phosphorylated protein kinase A (p-PKA) and phosphorylated CREB (p-CREB). In Western blot analysis, CG500354 increased the protein levels of GFAP and Tuj-1 as a result shown in immunocytochemistry. Moreover, CG500354 significantly increased the phosphorylation of PKA and CREB. These results were also confirmed and supported by cAMP measurement assay. Besides, CG500354 increased the p53 expressing GBM cells in immunocytochemistry. Taken together, CG500354 takes important roles in GBM growth arrest regulation through up-regulating the levels of cell-cycle-related and tumor-suppressor markers as well as neural differentiation markers.