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Application of the C-terminal fragment of Pasteurella multocida dermonecrotic toxin on the development of vaccines against progressive swine atrophic rhinitis

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Authors
김아름
Advisor
우희종
Major
수의과대학 수의학과
Issue Date
2013-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Progressive atrophic rhinitis (PAR)Pasteurella multocida D:4Pasteurella multocida toxinoral vaccineLactic acid bacteria (LAB)Lactococcus lactis
Description
학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 수의학과, 2013. 8. 우희종.
Abstract
Pasteurella multocida는 그람 음성의 병원성 미생물로서 다양한 종류의 야생 또는 가축 동물에 호흡기 질환을 일으킨다. P. multocida D형이 생산하는 P. multocida toxin (PMT)은 돼지의 진행성 위축성 비염을 일으키는 주요 감염인자이며, PMT 특이 항체는 질병의 보호에 기여한다고 알려져 있다. 선행연구에서 PMT의 C-terminal 부분 (PMT2.3)을 면역화 하였을 때 P. multocida D형 감염에 대하여 방어면역 (protective immunity)을 가진다는 것이 밝혀져 있다. 본 연구에서는 경구백신에 있어서 rPMT2.3의 효과를 입증하고자 PMT2.3을 발현하는 재조합 유산균주 Lactococcus lactis를 제조하였다. 이 재조합 유산균주의 백신효과를 보기 위해 실험용 마우스에 연속 3일간 2주 간격으로 경구투여 하였으며, 점막 면역 및 전신 면역 반응을 조사하기 위하여 분변과 혈액으로부터 rPMT2.3 특이 IgA와 IgG 항체가를 측정하였다. 동종의 공격접종에 대한 방어면역성 또한 측정하였다. PMT2.3을 발현하는 재조합 L. lactis종을 경구 투여한 경우, rPMT2.3 특이 IgA와 IgG 항체 및 동종 병원균의 공격접종에 대한 방어면역성은 관찰되지 않았다. 반면, rPMT2.3 단백질과 상용 위축성 비염 백신인 ART-T4를 복강 주사한 그룹의 마우스에서는 rPMT2.3 특이 IgA와 IgG 항체가 유효한 수준으로 유도되었고, 공격접종에 대한 방어면역성 또한 보였다. L. lactis종은 generally recognized as safe (GRAS) 등급으로 분류된 안전한 유산균주로서 가지고 있는 다양한 장점으로 인하여 경구백신의 carrier로 이용되고 있어 본 연구에서는 PMT2.3 단백질을 L.lactis 종에 성공적으로 발현시켰으나 필드에 적용될 수 있는 기능적인 경구백신을 만들기까지는 추후 연구가 필요하다.
다음으로, 지금까지 알려지지 않은 rPMT2.3 부분에 대한 immune effect를 더 연구하고자 rPMT2.3을 면역화시킨 마우스로부터 비장세포를 분리하여 cytokine의 분비양상을 비교하였다. 공격접종을 하기 전의 rPMT2.3에 의하여 감작된 비장세포에서는 IFN-γ의 분비가 유효하게 증가하였고, 공격접종 후 IL-4의 분비가 증가함으로써 cross-regulation 되었음을 확인하였다. 이것은 rPMT2.3의 면역화에 의해 Th1 과 Th2 타입 면역 반응의 유도에 관여하고 있음을 의미한다. PMT2.3의 이와 같은 효능은 백신제재로서의 용용 가능성이 충분함을 시사한다. 따라서, 상용 위축성 비염 백신인 ART-T4의 효능을 증진시키는 대체물로서 PMT2.3의 기능을 확인하고자 하였다. ART-T4에 rPMT2.3 단백질을 첨가하여 함께 접종한 경우 단일의 백신만을 접종한 경우보다 유효한 항체가와 방어성 면역이 현저히 증가하였으므로, ART-T4 상용백신의 효능을 증진시키는데 PMT2.3을 적용할 수 있을 것이라 생각된다.
Pasteurella multocida is a Gram-negative pathogen that causes respiratory diseases in wild and domestic animals. P. multocida D:4-producing P. multocida toxin (PMT) is a primary virulence factor in swine atrophic rhinitis and specific antibody against toxin is known to play a major role in protection. It has been reported that the C-terminal large fragment of PMT (PMT2.3) offers protective immunity against P. multocida D:4 infection in vaccination and challenge in mice. For investigation of oral-route vaccination effect of PMT2.3, a recombinant Lactococcus lactis expressing PMT2.3 was constructed in this study. Mice were immunized with live prepared cells by three day-consecutive oral administrations with a 2-week interval. The mucosal and systemic immune responses were investigated by detection of specific IgA and IgG from feces, and sera in the mice. The protective immunity against homologous challenge in the immunized mice was also examined. In oral administration, the recombinant L. lactis strain expressing PMT2.3 showed no production of sfecific antibodies and protection against homologous challenge. A mild protection against a homologous challenge with P. multocida was observed in mice vaccinated with rPMT2.3 and commercial vaccine. The PMT2.3 production process using the recombinant L. lactis can provide an approach to efficient production of recombinant protein using a generally recognized as safe (GRAS) lactic acid bacteria as a significant carrier for the oral-route vaccination. However, further study for achieving a functional oral vaccine was needed.
On the other hand, the immune effect of rPMT2.3 was not proven well in cytokine production analysis in from rPMT2.3 vaccinated mice. The levels of IFN-γ cytokines in rPMT2.3-stimulated splenocytes showed significant increase
however, after challenge, the level of IL-4 was increased in rPMT2.3 immunized mice. This results means that the rPMT2.3 was related to inducing Th1 type immune response and switched to Th2 type immune response after challenge. The protective function and cytokine changes of rPMT2.3 have been previously
therefore, the present study determined whether rPMT2.3 has potential application as material that can compensate for the effect of existing vaccine ART-T4. The immunization with atrophic rhinitis commercial vaccine containing rPMT2.3 protein showed a higher level of anti-PMT2.3 IgG and the survival rate was also increased after the challenge compared to immunization with ART-T4 only. As combination of ART-T4 and the rPMT2.3 protein improved antigenicity and protective effect of ART-T4, rPMT2.3 might be used as an effective component in P. multocida D:4 vaccine.
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/133700
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Appears in Collections:
College of Veterinary Medicine (수의과대학)Dept. of Veterinary Medicine (수의학과)Theses (Master's Degree_수의학과)
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