Single-molecule Fluorescence Study on Structural Roles of Guide RNAs in Activation of Cas9 Endonuclease

Abstract

원핵생물의 후천면역체계로서 최근들어 새롭게 발견된 크리스퍼 시스템 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR-associated (Cas) system) 은 외부의 바이러스나 플라스미드로부터 개체 스스로를 보호하는 기능을 수행한다. 여러 타입의 크리스퍼 시스템 중, 타입-II 시스템은 Cas9이라는 핵산절단효소 단백질과 두 가지의 가이드 RNA (gRNA: CRISPR RNA (crRNA) 와 trans-activating crRNA (tracrRNA))로 구성되며, 이 구성요소들이 단백질-RNA 복합체를 이루어 표적 DNA 를 인식하고 절단한다. 이 타입-II 크리스퍼/Cas9 시스템이 차세대 유전자 조작 기술로 유전공학 분야에 성공적으로 도입되면서, Cas9-gRNA 복합체에 대한 구조적 특성 연구도 활발히 진행되었다. 그러나 여전히 gRNA가 Cas9 핵산절단효소를 어떻게 활성화시키는지 그 구조변화에 대한 구체적인 동역학적 메커니즘에 대한 규명은 이루어지지 않은 실정이다. 이에, 우리는 단분자 형광 분광법을 도입하여 두 가이드 RNA가 Cas9 핵산절단효소 활성화에 있어 수행하는 구조적 역할에 대해 연구하였다. 그 결과, 정적인 앙상블 평균값만을 관찰하는 기존의 실험법들로는 알아낼 수 없었던 Cas9 시스템 작동 상의 세부적 메커니즘을 규명할 수 있었으며, 본 학위논문에서는 이 연구에 대해 논하기로 한다. 첫째로, tracrRNA는 정상 기능하는 Cas9-gRNA 복합체 (Cas9:gRNA)의 형성과정에 있어 핵심적인 역할을 수행함을 밝혀내었다. tracrRNA가 없는 경우, Cas9 단백질이 비활성화되어 Cas9:gRNA 형성이 이루어지지 않았다. 반면, tracrRNA-Cas9 상호작용이 가능한 경우에는 Cas9:gRNA가 형성되는 반응경로가 우세해지면서 Cas9의 비활성화는 관찰되지 않았다. 둘째로, tracrRNA가 Cas9:gRNA 형성에 관여하는 것과는 달리, crRNA는 Cas9:gRNA가 표적 DNA와 결합한 Cas9-gRNA-DNA 삼중 복합체 (Cas9:gRNA:DNA)에서 Cas9 핵산절단효소의 활성화 여부를 조절하는 것으로 밝혀졌다. Cas9:gRNA:DNA 내의 crRNA와 DNA 사이에 형성되는 R-loop 구조는 열린 구조 (open conformation)와 잠긴 구조 (zipped conformation)라고 명명한 두 하위 구조로 존재하며, R-loop 구조는 실제적으로 이 두 구조를 계속해서 왔다갔다 반복하는 내재적인 동역학적 특성을 지니고 있음이 발견되었다. 나아가, 잠긴 구조가 만들어져야만 DNA가 절단된다는 것을 관찰함으로써, 이러한 crRNA와 연관된 구조 동역학적 특성이 Cas9 절단효소 활성화에 핵심임을 밝혀내었다. 종합하자면, 이러한 결과들은 Cas9 핵산절단효소의 구조적 활성화에 있어 gRNA의 역할에 대한 세부 메커니즘 수준에서의 이해를 가능케 하였다.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR-associated (Cas) system has recently been discovered as a prokaryotic adaptive immune mechanism against invading viruses and plasmids. Among various types of the CRISPR/Cas systems, type-II consists of Cas9 endonuclease and two guide RNAs (gRNA), CRISPR RNA (crRNA) and trans-activating crRNA (tracrRNA), whose ribonucleoprotein complex recognizes and cleaves target DNA. Although extensive structural studies of Cas9-gRNA complex has been carried out since the CRISPR/Cas9 system was successfully employed to genome editing, the detailed mechanism and dynamics of gRNAs in the structural activation of the Cas9 endonuclease are still elusive. Herein, we review our studies on the structural roles of the two guide RNAs in the activation of Cas9 endonuclease using pseudo-ensemble and single-molecule fluorescence spectroscopic assays, thereby providing mechanistic details which are not available from other static and/or ensemble-averaged measurements. Firstly, tracrRNA was found to be critical in the formation of functional Cas9-gRNA complex (Cas9:gRNA). In the absence of tracrRNA, the Cas9 protein became inactivated so that it failed to form Cas9:gRNA, whereas tracrRNA-Cas9 interaction prevented the inactivation pathway by leading Cas9 toward a complexation pathway for Cas9:gRNA. Secondly, crRNA was found to regulate the nuclease activation of Cas9 after Cas9:gRNA bound to the target DNA with forming Cas9-gRNA-DNA ternary complex (Cas9:gRNA:DNA). R-loop structure between crRNA and the target DNA in Cas9:gRNA:DNA exhibited intrinsically repetitive transitions between two distinct sub-conformations termed open and zipped conformations. This crRNA-related conformational dynamics was proved to be a crucial factor for the nuclease activation by the observation that the bound DNA was cleaved only when the zipped conformation formed. Overall, these results show mechanistic insights into the gRNA-associated structural activation of the Cas9 endonuclease.