Spectroscopic and Microscopic Studies on Biomolecules and Optoelectronic Devices

Abstract

빛과 물질의 상호작용은 과학적으로 흥미로운 다양한 현상들을 일으킨다. 그 상 호작용에 의해 신호의 변화를 탐지하고 분석하는 분광학은 양자 역학의 발전의 핵심이었을 뿐만 아니라 물리적 화학적 분석에 널리 사용되고 있다. 또한 그 신 호를 공간적으로 형상화 하는 현미경 관찰법의 활용은 탐구대상의 구조나 화학적 조성에 대한 직접적 정보를 제공한다. 광학 분광기나 현미경은 살아있는 개체를 훼손하지 않고 실시간으로 관찰할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 물리화학적 광학 기술을 활용해 기존에 해결할 수 없었던 생물학적 문제에 접근해보고자 했다. 빛의 고유한 회절 한계로 인해 광학 현미경으로는 아주 가까운 위치에 있는 두 물체를 구분할 수 없다. 회절 한계는 대략 파장의 절반 정도 (가시광선의 경우, 300 nm) 인데, 이는 생분자의 크기 (1–10 nm) 보다 훨씬 크다. 최근 분자의 광물 리적 특성을 이용해 회절한계를 극복한 초고분해능 현미경들의 개발로 살아있는 세포 내의 세포 소기관, 단백질, 핵산 등의 생분자를 관찰할 수 있다. 우리는 STED (stimulated emission depletion) 초고분해능 현미경을 이용해 세포 내 류실 tRNA 합성효소의 정확한 위치를 확인할 수 있었다. 류실 tRNA 합성효소는 세포 증식, 단백질 합성 및 자가 영양을 포함한 생리 기능에 영향을 미치는 mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) 이라는 단백질 복합체를 활성화시키는 역할 도 한다는 보고가 있었다. 우리는 류신이 있을 때 LRS가 mTORC1 이 생성되는 리소좀으로 이동하는 것을 확인하고, STED 현미경을 사용해 LRS는 리소좀의 내 부가 아닌 막에 존재한다는 사실도 밝혔다. 이는 LRS가 류신에 의해 mTORC1 을 활성시킨다는 직접적인 이미지 증거로 류실 tRNA 합성 효소의 새로운 역할을 초고분해능 이미지로 확인했다. 단분자 형광 분광학은 형광 분자 각각의 물리화학적 현상을 관찰하는 방법으로 여러 분자를 동시에 관찰할 때는 평균에 가려져 볼 수 없었던 단일 분자의 거동을 관찰할 수 있다. 특히 생체 분자는 환경에 따라 균일하지 않은 상태로 존재하기 때 문에 각각의 상태를 확인하기 위해서는 단분자를 관찰할 필요가 있다. 단분자 형광 분광학으로 단일 가닥 DNA 의 유연한 구조를 밝혔다. 단일 가닥 DNA 의 구조에 대한 이해는 세포의 유전 과정을 해석는데 결정적이지만, 나노 미터 길이에서의 동 적 변화 구조를 측정하는 것은 실험적으로 어려웠다. 교차 레이저 여기법을 적용한 단분자 형광 공명 에너지 전달(ALEX-FRET) 분광학을 이용해 단일 가닥 DNA의 구부러지는 정도를 확인했다. 다양한 길이의 단일 가닥 돌출부가 있는 이중 가닥 DNA 시스템을 설계하고, DNA의 특정 위치에 있는 두 형광단 사이의 형광 공명 에너지 전달 효율(FRET efficiency)을 측정해 단일 가닥 DNA의 유연성을 결정했 다. 지속 길이보다 짧은 세 개 염기 서열을 가진 단일 가닥 DNA가 구부러진다는 사실을 발견했다. 공초점 현미경을 기반으로 하는 단분자 분광학에서도 회절 한계로 인해 분자를 하나씩 관찰하기 위해서는 농도를 아주 낮게 (50 pM) 유지해야 한다. 세포 안의 효소같은 생분자들은 그보다 100 배 높은 (5 nM) 수준에서 주로 작동한다. 우리는 STED 현미경법을 단분자 분광학에 적용해 광학 회절 한계보다 약 100 배 작은 부피에서 확산하는 단분자를 관찰했다. 이로써 전형적인 단일 분자 측정 조건보다 약 100배 높은 5 nM 농도에서도 단일 분자 검출이 가능했다. 이중 가닥 DNA 에 두 가지 형광 분자를 표지해 새로운 기술의 실현 가능성을 시연했다. 이 새로운 기술 은 생체 내 확산하는 단일 생분자를 직접 관찰할 수 있는 기술로, 다양한 생화학적 문제를 해결하는 역할을 할 것으로 기대한다. 앞서 익히고 개발한 분광학 기술 등을 생분자 뿐 아니라 유기 광전소자에도 적용했다. 특히 전압을 받아 빛을 발생하는 유기 발광 다이오드(OLED)의 열화 과정을 시분해 분광학으로 분석함으로써 열화의 매커니즘을 실시간으로 관찰 및 분석할 수 있었다. 디스플레이의 수준을 넘어, 강한 빛을 내는 조명 등에 OLED를 활용하기 위해서는 짧은 소자 수명이 문제가 된다. 열화 발생 시 주변보다 상대적 으로 에너지준위가 낮은 결함(defect)에 갇힌 전하 운반체는 여러 경로로 소자의 발광을 저해하는데, 그 중 전하 트랩은 실험적으로 관측이 어렵다. 우리는 시분해 전계발광(transient electroluminescence) 기술에 새로운 분석 방법을 접목해 열화 시 전하 트랩의 증가를 관찰하고, 그로 인한 발광 특성의 변화를 밝혔다. 전압이 들어간 순간부터 처음 빛이 발생할 때까지의 시간(t0)은 소자가 열화될 때 감소한 다. 유기층의 전하 트랩에 갇힌 전하 캐리어는 전극에서 주입된 전하 캐리어보다 먼저 마주치기 때문이다. 발광 수명(td)은 점점 증가했는데, 이것은 전하 트랩의 뒤늦은 결합으로 설명이 가능하다. t0 의 감소와 td 의 증가로 전하 트랩의 존재를 확인했으며, 전하 트랩이 발광에 미치는 영향을 알 수 있었다. TREL 측정 기술에 새로운 분광학 분석 방법을 적용해 손쉽게 전하 트랩을 분석할 수 있는 방법을 개발했다. 이는 범용적으로 활용될 수 있는 발광/수광 소자의 실시간 전하 트랩 분석 기술로 소자의 열화 메커니즘 연구 및 새로운 특성 연구에 활용될 수 있다. OLED 소자가 열화될 때 어느 층이 원인인지 알기 위해서는 화학적 분석이 필요하다. 광학 기술은 다른 화학적 분석 기술과 달리 형광의 세기와 수명 관측을 통해 광화학적 성질 비침습적으로 분석할 수 있다. 그러나 소자 내 유기층의 두께 는 수 십 nm로 광학 회절 한계보다 얇아서 공간적으로 각 층을 구분하기 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해 각 층을 밴드갭이 다른 물질들로 구성해 소자를 제작하 는 방법을 선택했다. 광원은 모든 층을 동시에 여기시키지만 각 층에서 발생되는 빛은 각각 다른 파장을 갖기 때문에 이를 스펙트럼상에서 분리할 수 있다. OLED 의 열화과정 동안 세 가지 물질을 광학적을 분리해서 실시간으로 관측함으로써 TREL 기술의 실현 가능성을 보였다. 이는 분자의 광학적 특성을 분석해 화학적 변화를 알아낼 수 있는 간편한 기술로 다양한 다층 소자 연구에 적용할 수 있다.

The interaction of electromagnetic radiation and matter arouses a variety of scientific interests. Spectroscopy, the study of detecting and analyzing changes in light by light-matter interaction, has played a central role in the development of quantum mechanics and is still being used for physical and chemical analysis. Optical microscopy that spatially visualizes signals from light-matter interaction provides direct information on the structure and chemical composition of objects. We can observe living species in situ noninvasively using an optical spectrometer or microscope. During my Ph.D. course, I tried to solve some biological and optoelectronic questions using optical techniques. A far-field optical microscope cannot distinguish two objects in close proximity because of the inherent diffraction limit of light. Recent developments of super-resolution microscopy that overcome the diffraction limit by using the photophysical properties of fluorophores enable us to observe small objects such as organelles, proteins, and DNA in living cells. The precise location of intracellular proteins was confirmed using a stimulated emission depletion (STED) microscope, one of the super-resolution microscopes. Leucyl-tRNA synthetase (LRS) plays a major role in providing leucine-tRNA and activating the mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) through intracellular leucine sensing. mTORC1 influences physiological functions including cell proliferation, protein synthesis, and autophagy. Using a STED microscope, we verified the hypothesis that LRS is translocated to the lysosome membrane by the addition of leucine. This direct visualization proves the function of LRS as an intracellular leucine sensor and positive regulator of amino-acid signaling to mTORC1. Since biomolecules exist in heterogeneous environments, it is necessary to observe the state of each molecule. Single-molecule spectroscopy enables us to observe single molecules without ensemble averaging. Here, we demonstrate that single-molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) spectroscopy can be used to probe the flexibility of a single-stranded DNA (ssDNA). ssDNA is crucial for understanding the biological machinery in a cell nucleus but understanding its characterization has been difficult because of the dynamically changing structure of ssDNA in nanometer scale. We designed a double-stranded DNA system with various lengths of single-strand overhang and determined the flexibility of the single-stranded segment by measuring the FRET value. We found that three of our ssDNAs with lengths shorter than the persistence length were long enough to undergo folding. We also found that there is no significant effect of charge screening by metal ion when the ssDNA is less than 9 bases in length. Even in single-molecule detection based on a confocal microscope, the concentration should be lower than 50 pM to observe single molecules due to the diffraction limit. Intracellular biomolecules such as enzymes work at levels 100 times higher (5 nM). With the combination of STED microscopy and single-molecule FRET spectroscopy, we break the concentration barrier in diffusion based single molecule spectroscopy. We were able to detect single molecules diffusing in a tightly confined volume 100 times smaller than the diffraction limited confocal volume. The feasibility of this new technique was demonstrated using the dual-labelled dsDNA molecule. With this new technique, we showed that single-molecule detection is possible at concentrations up to 5 nM. We applied the spectroscopic techniques to optoelectronic devices as well as biomolecules. In particular, the degradation mechanism of organic light emitting diodes (OLEDs) was investigated by time-resolved spectroscopy. It is important to understand the detailed mechanism of the degradation of OLEDs to improve device stability and performance. During the degradation, charge carriers are confined in chemical defect sites called charge traps. The charge traps, which degrade device performance, are difficult to experimentally observe. Transient electroluminescence (TREL) is capable of observing the charge traps and elucidating the effect of the charge traps on OLED luminescence. Onset time (t0), the time between the first application of operating voltage and light emission, decreases as the device undergoes degradation. The charge carriers trapped inside the organic layer encounter each other earlier than the charge carriers generated from the electrodes. Decay time (td), the luminescence lifetime, increases during degradation, which can be explained by the delayed recombination of the charge traps. The decrease of t0 and the increase of td confirms the presence of the charge traps and their effect on luminescence. Spectroscopic TREL measurement enables the investigation of the charge traps in situ and is universally use for studying the device degradation mechanism and understanding its properties. Chemical analysis of the degraded OLED device is needed to examine which specific layer in the OLED device is degraded. Unlike other chemical analysis techniques, optical spectroscopy enables non-invasive analysis of the photochemical properties through luminescence intensity and lifetime analysis. However, the thickness of each layer is about tens of nanometers and therefore cannot be optically resolved because of the diffraction limit. A specially designed device consisting of layers with different bandgaps was used so that each layer emitted light of a different wavelength. The layers could not be resolved spatially but could be resolved spectrally. We observed spectroscopically the behavior of three materials in the device during the degradation process. This simple optical technique for layer selective characterization will be very useful in the study of various multi-layer devices.