Synthetic modified SOX2 mRNA-mediated direct lineage reprogramming of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into neural stem cells

Abstract

자가재생능을 가지며 다분화능을 가진 신경줄기세포는, 신경퇴행성질환의 치료를 위한 병리학적 이해 및 새로운 치료법 개발에 있어 활용가치가 유망한 세포이다. 최근에는 체외에서 생산한 신경줄기세포, 즉 유도신경줄기세포를 생산하기 위하여 세포의 직접교차분화 방법이 다양하게 개발되고 있다. 기존에 확립된 바이러스를 매개로 한 직접교차분화법은 유전적 안정성의 문제로 인하여 염색체 비-삽입성 직접교차분화법을 이용함으로써 임상에 이용할 수 있는 신경줄기세포를 유도하는 법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 체외에서 전사된 mRNA는 체내에 일시적으로 존재하며 염색체에 삽입이 되지 않는다는 점에서 유전적으로 안전한 직접교차분화법 중 하나이다. 이번 연구에서는 체외에서 인공적으로 합성 및 변형된 SOX2 mRNA를 생산하고, 제대혈 유래 중간엽줄기세포에 최적화된 조건으로 이를 형질주입하여 증식이 가능한 신경줄기세포를 유도해 내는 것에 성공하였다. 우리는 제대혈 유래 중간엽줄기세포에서 유도된 신경줄기세포 (UM-iNSCs) 가 신경줄기세포의 특징인 다분화능과 자가재생능을 가지는 것을 확인하였다. 더불어 우리는 인간 피부 섬유아세포에 SOX2를 암호화하는 mRNA를 체외에서 전사되도록 하여 형질 주입하였다. 형질 주입된 피부 섬유아세포는 형태학적으로나 신경줄기세포 관련 유전자의 발현 수준이 배아줄기세포 유래의 신경줄기세포와 유사하였다. 하지만 증식능력의 한계를 보였다. 이번 연구에서는 비-삽입성 직접교차분화법인, 단일 인자를 암호화하는 mRNA를 체외에서 인공적으로 합성 및 변형 하여 형질주입 함으로써 인간 제대혈 유래 중간엽줄기세포를 유도신경줄기세포로 직접교차분화 시킬 수 있음을 확인하였으며 이는 치료적 이용에 좋은 수단으로 이용될 수 있을 것이다.

Neural stem cells (NSCs) are a prominent cell source for understanding neural pathogenesis and for developing therapeutic applications to treat neurodegenerative disease because of their regenerative capacity and multipotency. Recently, a variety of cellular reprogramming technologies have been developed to facilitate in vitro generation of NSCs, called induced NSCs (iNSCs). However, because of concerns about the genetic safety of established virus-based reprogramming methods, non-integrating reprogramming methods have been developed. Here, we generated modified mRNA (modRNA) encoding SOX2 in vitro, and transfected mRNA into human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (UCB-MSCs) for neural reprogramming. This is a genetically safe reprogramming method that utilizes properly optimized transfection conditions for efficient reprogramming. As a results, we successfully generated expandable iNSCs from UCB-MSCs via transfection with SOX2 mRNA. We confirmed that generated UCB-MSC-derived iNSCs (UM-iNSCs) possess self-renewal capacity and can differentiate into three neural lineages. Additionally, we transfected human dermal fibroblasts (HDFs) with SOX2 mRNA. Compared with human embryonic stem cell-derived neural stem cells, HDFs transfected with SOX2 mRNA exhibited neural reprogramming with similar morphologies and NSC-enriched mRNA levels, but they showed limited proliferation ability. Our results demonstrated that human UCB-MSCs can be used for direct reprogramming into iNSCs through transfection with modRNA encoding a single factor, which provides an integration-free reprogramming tool for future therapeutic application.