Generation and analysis of transgenic cattle with germline transmission via transposon

Abstract

형질전환소는 가축의 기본적인 유전적 기능이나 성능을 이해하는데 있어 매우 중요한 동물 모델이다. 하지만 형질전환소를 생산·유지하는 기본 비용이 많이 들고, 배아의 생존율과 이식 성공률이 낮기 때문에 형질전환소를 생산하는데 어려움을 겪고 있다. 따라서 가장 기본적이고 초기 단계인 형질전환 배아를 생산할 때 발현시키고자 하는 형질을 안정적이며 높은 효율로 유전체에 전달하는 유전자 전달 기술을 적용하는 것이 중요하다. 유전자 전달 기술로서는 크게 바이러스성과 비바이러성으로 나뉜다. 바이러스성 유전자 전달 장치는 유전자 발현율이 높아 다양한 연구에서 이용되었지만 사용하기 어렵고, 비특이적으로 염색체에 끼어 들어가기 때문에 암을 유발할 수 있는 유전자를 활성화시키는 문제점을 가지고 있다. 비바이러스성 유전자 전달 장치는 바이러스성 유전자 전달 장치에 비해 사용하기 편하고 낮은 독성을 가지지만 유전자 전달 효율이 낮다. 하지만 트랜스포존 시스템를 이용하면 이러한 단점을 해결할 수 있다. 트랜스포존 시스템은 비바이러스성 유전자 전달장치로써, 여러 연구를 통해 실험 방법이 간단하고, 높은 효율로 다양한 종류의 형질전환 동물을 생산할 수 있음이 확인되었다. <br/> 외부 형질을 안정적으로 발현하는 형질전환소를 생산하기 위한 첫번째 단계로 트랜스포존이 세포의 유전체에 높은 효율로 삽입되는지를 확인하였다. 이를 위해 전체적으로 녹색 형광을 발현하는 보통의 플라스미드와, 2가지 종류 (슬립핑 뷰티, 피기백)의 트랜스포존과 이를 유전체에 높은 효율로 삽입시키는 역할을 하는 트랜스포세이즈를 같이 세포에 형질전환시켰다. 그 결과 피기백 트랜스포존이 높은 효율로 세포에 외부 형질을 전달하는 것을 확인하였다. <br/> 트랜스포존을 이용하여 외부유전자를 높은 효율로 유전체에 삽입되는 결과를 확인한 후, 두 종류의 트랜스포존 시스템을 이용하여 세가지 종류의 발현 시스템을 가진 형질전환소를 생산하였다. 첫째로 슬립핑 뷰티 트랜스포존을 이용하여 전체적으로 황색 형광 단백질을 발현하는 개체를 생산하였고, 둘째로 피기백 트랜스포존과 Dre-rox 발현 조절 시스템을 이용하여 녹색 형광 단백질과 적색 형광 단백질의 발현을 특이적으로 조절할 수 있는 개체를 생산하였으며 마지막으로 피기백 트랜스포존과 조직 특이적 발현 시스템을 이용하여 유선 특이적으로 특정 단백질을 발현하는 개체를 생산하였다.<br/> 세 종류의 형질전환 개체를 만들 수 있는 트랜스포존 시스템을 소의 수정란에 미세 주입하였고, 형광 단백질이 발현되는 배반포를 선별하고 대리모에 이식하여 9마리의 형질전환소를 생산하였으며 생산된 일부 형질전환소에서 육안으로 형광을 관찰할 수 있을 정도의 매우 강한 형광이 발현되는 것이 확인되었다. 형질전환 개체의 외부 유전자 삽입 위치를 확인하고 그 위치에 따른 다양한 변이가 있는지 확인하기 위해 차세대 유전자 염기서열 분석을 하였다. 그 결과, 개체의 유전체에서 다른 유전자의 발현에 영향을 끼치지 않는 부분에 삽입되는 트랜스포존의 기본 특성대로 안전한 위치에 삽입되었고, 일반소와 비교했을 때 유의할만한 유전체의 복제 수 변이나 구조적 변이가 일어나지 않았다. 또한 생산된 형질전환 개체 중, 성성숙된 암컷 개체에서 과배란을 통해 얻은 난자와 수컷 개체의 정자로부터 얻은 수정란에서 미세 주입된 외부 유전자의 발현을 확인하였다. 이는 트랜스포존 시스템을 이용하여 생산된 형질전환 개체가 획득한 외부 유전자를 다음 세대에 전달할 수 있는 생식선 전이 능력을 가지는 것을 말한다. <br/> 그 다음으로 삽입된 외부유전자가 실제로 2 세대 자손으로 유전되는지 확인하였다. 성성숙된 트랜스포존-형질전환소를 자연적으로 교배시켜 2 세대 자손을 획득하였고, 부계의 형질전환 유전자인 녹색 형광을 별도의 장치없이 눈으로 확인 할 수 있었다. 2세대 자손의 귀 조직으로부터 얻은 피부섬유아세포를 분석한 결과 전체적으로 녹색 형광 단백질의 발현이 확인되었고, 모체 쪽 외부유전자인 황색 형광 단백질은 검출되지 않았다. 이는 부계의 형질 전환 유전자만이 안정적으로 2 세대로 유전되었음을 말한다. 부계로부터 유전된 외부 유전자의 위치를 정확하게 확인하고 전체 유전체의 안정성을 확인하기 위하여 차세대 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과 외부 유전자는 총 3개가 삽입되었으며 그 중 2개가 부계의 외부 유전자 삽입 위치와 같은 위치에 있는 것을 확인하였다. 또한 유전체 안정성 검사 결과, 일반소와 형질전환소 간의 유의적인 차이가 없었다. 생산된 형질전환 개체는 길게는 51개월 이상 건강상의 문제 없이 자라고 있으며 대용량의 혈액과 고기를 보유하고, 우유를 생산하기 때문에 최근 개발된 유전자 편집 기술을 적용하여 확인된 외부 유전자의 삽입 위치에 유용 단백질을 삽입시킨다면 차세대 바이오 리액터로 이용할 수 있다.<br/> 본 연구에서는 처음으로 트랜스포존 시스템을 적용하여 다양한 종류의 유전자 발현 시스템과 안정적인 유전체를 가진 형질전환 소를 효율적으로 생산하였다. 이러한 비바이러스성 유전자 전달 기술은 형질 전환 소를 높은 효율로 생산할 수 있을 것이며, 축산업 및 수의학 등의 다양한 분야에서 적용될 수 있을 것이다.<br/>