Development of KASP markers derived from single-locus-unique nuclear genome and chloroplast genome of allotetraploid Panax ginseng

Abstract

고려인삼은 두릅나무과 Panax 속에 속해있으며, Panax는 만병통치약이라는 의미를 가지는 Panacea를 어원으로 한다. 그리고 그 이름에 걸맞게 인삼은 진세노사이드라고 불리는 유효성분을 함유함으로써 다양한 약리학적 효능을 가지며 대표적인 기능성 식물로 자리잡았다. 반면에 유전학적 연구는 많이 이루어지지 못했는데, 인삼은 재배조건이 까다롭고 복잡한 유전체 구조를 가지고 있기 때문이다. 특히 인삼은 whole genome duplication에 의해 이질배수체화됨으로써 유전체 내에 파라로그한 서열이 많이 존재하게 되어, 분자마커 개발 및 유전학적 연구를 더디게 하였다. 이번 연구를 통해 핵 유전체와 엽록체 유전체를 대상으로 인삼의 유전체적 특성을 이해한 KASP마커를 제작하였다. KASP는 FRET 형광을 탐지하여 단시간에 보다 정확한 지노타이핑이 가능하도록 하는 장점이 있다. 하지만 이질사배체인 인삼의 GBS 데이터를 가지고 KASP를 개발하고자 할 때, 파라로그한 지역의 SNP는 제거하고 단일 유전자자리의 SNP만을 발굴해낼 수 있는 파이프라인이 필요했다. 따라서 이번 연구 과정을 통해 보완된 파이프라인을 디자인하여 KASP 개발에 이용될 수 있는 SNP 발굴에 성공했고, 그 결과 핵 유전체를 대상으로 10개의 KASP마커를 개발할 수 있었다. 또한 엽록체 유전체를 대상으로도 KASP마커를 개발하였다. 먼저 변이 지역을 탐색하기 위해 국내 및 해외로부터 수집된 인삼 11개를 danLCW를 이용하여 엽록체를 완성하였고, 그 결과 156,355-156,356 bp에 이르는 엽록체 유전체를 완성하였다. 이는 86,128-86,129 bp의 LSC, 18,077 bp의 SSC, 26,075 bp의 IR로 구성되어 있음을 확인하였고, 유전체 내에 79 개의 CDS, 30 개의 tRNA, 4 개의 rRNA를 가지고 있음을 확인하였다. 이 엽록체 유전체들은 총 6개의 그룹으로 나눠볼 수 있었고, 각 그룹은 서로 완벽히 일치하는 서열을 가진다. 그리고 이들 간의 변이는 6개의 SNP와 1개의 InDel로 확인되었다. 또한 보다 심도깊은 인삼의 엽록체 연구를 위해 선행연구를 통해 완성된 12개의 인삼 엽록체와 함께 비교하여 전체 23개의 인삼을 10개의 그룹으로 분류할 수 있었고, 이들 간에 9개의 SNP, 6개의 InDel을 확인하였다. 결과적으로 핵 유전체와 엽록체 유전체의 단일유전자자리의 SNP를 기반으로 KASP마커를 개발하였고, 유전형 데이터를 이용하여 연구에 쓰인 94개의 인삼 개체를 그룹핑하고, 이들간의 근연관계를 분석하였다. 이 정보는 후에 인삼의 유전학적 연구의 기반이 될 것이며, 이 연구를 통해 개발된 마커들은 다른 인삼 유전자원에 적용되어 육종 및 분류학적 연구에 기여할 것으로 예상된다.

P. ginseng belonging to the Araliaceae family is a member of Panax genus which has a variety of pharmacological effects. However, genetic studies of P. ginseng havent been conducted much due to the complex genome structure. It is arduous process to develop molecular markers without understanding the genetic characteristics of ginseng. To develop useful markers for ginseng breeding, high-throughput of SNPs were investigated through genotyping by sequencing (GBS) analysis using various ginseng genetic resources. The pipeline for calling out only single-locus-unique SNPs was designed and 10 Kompetitive allele specific PCR (KASP) markers were developed on the nuclear genome by considering the characteristics of allotetraploid ginseng. The chloroplast genomes of 11 ginseng genetic resources were also completed to detect intra-specific variations. For a deep study of chloroplast genome of ginseng, the sequences were compared with the chloroplast sequences revealed in the previous research. As a result, 9 SNPs and 6 InDels were detected among 23 individuals, and they were divided into 10 groups with the genotype data. Consequently, 14 KASP markers developed from single-locus-unique nuclear genome and chloroplast genome of allotetraploid P. ginseng were applied to 94 ginseng genetic resources and identified to be able to group them well. Also, they could be used for accurate genotypes and classifications and showed that intra-specific diversity of the breeding lines and wild collections was not significantly different. This information will provide valuable source to ginseng genetic diversity study as essential tools for ginseng breeding and classification.