Metabolomics Study in Cnidium officinale Accessions by Multivariate Analysis

Abstract

Cnidium officinale is a plant belonging to the genus Umbelliferae. Its rhizome, Cnidii Rhizoma, has traditionally been used for many purposes such as blood circulation and analgesic effects, and has recently been reported to have anti-inflammatory activity and significant efficacy in female diseases. In Korean Pharmacopoeia, Cnidii Rhizoma has designated rhizome of both Cnidium officinale and Ligusticum chuanxiong. Although C.officinale and L. chuanxiong are the official source for Cnidii Rhizoma in Korea, sometimes they are intentionally or non-intentionally adulterated with the root stem of Ligusticum sinense due to their morphological and chemical similarities. In addition, C. officinale and L. chuanxiong are designated to the origin plants of Cnidii Rhizoma in the Japanese pharmacopoeia (JP) and the Chinese pharmacopoeia (CP), respectively. With the rise of international trade, increasingly, it is unclear which plant is used for Cnidii Rhizoma. Thus, it is important to clearly discriminate the origin of Cnidii Rhizoma. In the present study, we investigated the metabolic differences among genera or species for Cnidii Rhizoma using UPLC-DAD-QTOF-MS combined with multivariate analysis. The spectral data of C. officinale, L. chuanxiong and L. sinense derived from UPLC-DAD-QTOF-MS or NIRS were analyzed by principal component analysis (PCA) to evaluate their clustering pattern. When there is a clustering pattern between the samples, an OPLS-DA model was constructed based on UPLC-MS data and the metabolic markers contributing the clustering pattern were derived through S-plot analysis. As a result, senkyunolide I and senkynolide H were detected only in L. sinense whereas bisabolangelone was not detected only in the same sample, when comparing the MS fragment sepctra and DAD spectra of the tested samples. Since C. officinale and L. chuanxiong were almost identical in chemical composition, we tried to identify the important metabolites most contributing to distinguish them from each community using PCA and S-plot of OPLS-DA of their MS data. The results of this analysis showed that the content of phthalide type metabolites including Z-ligustilide and diligustilide leads to a meaningful distinction. Among them, the content of diligustilide type compounds were low in the plants and their UV absorbance was consequently low either. Therefore, the quantitative determination method for Z-ligustilide was developed using HPLC-DAD. In addition, the NIR spectra of the tested samples and their Z-ligustilide contents were compared. Taken together, UPLC-DAD-QTOF-MS analysis and the multivariate analysis of the spectral data of the C. officinale accessions could find their metabolic differences . Therefore, this study can be a reference for the differentiation of C. officinale, L. chuanxiong and L. sinense. Moreover, a rapid determination method for some important metabolic markers, Z-ligustilde, was developed using NIR spectroscopy, which was confirmed by HPLC-DAD.

천궁 (Cnidii Rhizoma)은 산형과 (Umbelliferae)에 속하는 식물로서 전통적으로 혈액 순환을 원활하게 하고 진통, 항염 효과 및 여성 질환에 뛰어난 효능 등의 활성이 알려져 있다. 하지만 이러한 천궁 (Cnidii Rhizoma)에 대하여 대한민국약전에서는 천궁 (Cnidium officinale)과 중국천궁 (Ligusticum chuanxiong) 두 가지 식물 모두를 기원식물로 지정하고 있다. 그에 반해 일본약국방 (JP)에서는 천궁 (C. officinale)만을, 중국약전 (CP)에서는 중국천궁 (L. chuanxiong)만을 기원식물로 설정하고 있다. 더불어 우리나라 식품공전에서도 천궁 (C. officinale)만을 기원식물로 지정하고 있다. 추가적으로 중국고본 (Ligusticum sinense) 또한 성상 및 구성 성분이 유사하여 혼용 우려가 있다. 이렇듯 나라 및 공정서 별로 천궁이라는 같은 생약명에 대한 기원식물이 상이하므로 이들 구별의 필요성이 제기된다. 그리하여 본 연구에서는 천궁 계통 식물들 사이에 대사산물의 상관성을 관찰하고자 대사체학을 기반으로 분석을 진행하였다. 천궁 (C. officinale), 중국천궁 (L. chuanxiong) 및 중국고본 (L. sinense) 서로의 군집 패턴을 알아보고, 군집 경향성에 영향력 있는 이차대사산물을 동정하기 위하여 UPLC-DAD-QTOF-MS와 NIR 분광법을 사용하여 시료를 분석하였다. 분석 결과에 대하여 다변량 통계 분석 방법의 일종인 PCA를 종 별로 시행하여 대사체가 유의미한 구별로 이어지는지를 확인하였다. 그룹 간 구별되는 경우, UPLC-MS 데이터를 기반으로 OPLS-DA 모델을 구축하고 S-plot 분석을 통해 그에 기여하는 대사체 마커를 규명하였다. 그들 중 중국고본 (L. sinense)는 구성 성분들 중 상이한 대사체인 senkyunolide I 및 senkyunolide H를 MS fragment 및 DAD spectrum을 통하여 positive marker로 설정할 수 있음을, 그리고 bisabolangelone을 negative marker로써 구별할 수 있음을 확인하였다. 천궁 (C. officinale)과 중국천궁 (L. chuanxiong)은 구성 성분이 동일하였기에, 이들의 MS data를 활용한 PCA 및 OPLS-DA의 S-plot을 통해 각 군집에 가장 크게 기여하는 대사체를 확인하였다. 그리하여 phthalide 계열 성분인 Z-ligustilide와 diligustilide계열 성분들의 함량이 유의미한 구별로 이어짐을 확인하였다. 그들 중 diligustilide계열 성분들은 해당 식물들에서 함유량이 낮고 UV detection이 낮기 때문에 Z-ligustilide에 한에서만 HPLC-DAD를 활용하여 천궁 계통 식물들을 대상으로 ligustilide의 정량법 개발 및 함량평가를 진행하였다. 그리고 천궁 계통 식물들을 NIR 분광법으로 측정한 data와 함께 해당 성분들에 대한 정량 결과를 비교해보았다. 이상의 연구결과는 천궁 계통 식물들을 대상으로 혼용 우려에 대한 유의미한 구별을 대사체학 관점에서 제공하였다. 따라서 본 연구는 천궁 (C. officinale), 중국천궁 (L. chuanxiong) 및 중국고본 (L. sinense) 감별법의 참고가 될 수 있으며, 특정 성분의 함량이나 약리 활성에 대한 참고가 될 수 있을 것으로 사료된다.