NAD(P)-dependent steroid dehydrogenase-like, involved in cholesterol biosynthesis, regulates proliferation and metastasis in breast cancer

Abstract

Background Breast cancer is the most common cancer for women. Target genes are extracted based on Next generation sequencing (NGS) data for breast cancer patients to regulate their emergence and to study their function and mechanism in the formation and progression of cancer. In this study, we studied NAD(P)-dependent steroid dehydrogenase-like (NSDHL), involved in cholesterol biosynthesis.

Methods To detect NSDHL expression in breast cancer cells, we used SYBRTM Green Real-Time PCR, western blotting assay. To generate NSDHL knock-down cells, cells were transfected with siRNA using Lipofectamine 2000TM. Cell proliferation assay, cell cycle analysis, 3D culture, clonogenic assay, migration assay, invasion assay, wound healing assay and total cholesterol assay of functional studies were performed. In addition, we identified erlotinib is efficient for treatment, as a target drug for NSDHL. Finally, we transfected shRNA of NSDHL in MDA-MB-231 and confirm NSDHL ability in NOD/SCID gamma mice. Clinically, we have performed Cox proportional hazard ratio model analysis for the effect of NSDHL expression on recurrence free survival (RFS) rates by using microarray gene expression data and clinical data deposited in Gene expression omnibus (GEO) database and also used in previous investigations.

Results Both NSDHL mRNA and protein levels were highly expressed in luminal A breast cancer cell (MCF7) and triple negative breast cancer cells (MDA-MB-231, BT-20) than normal breast cancer cell (MCF10A). Silencing of NSDHL by siRNA decreased proliferation (p< 0.01), differentiation in breast cancer cells and sensitive at erlotinib. Also, NSDHL inhibited migration and invasion in triple negative breast cancer, especially in MDA-MB-231 cell (p< 0.01). Additionally, we found that NSDHL regulated total cholesterol levels. In in vivo, we observed that NSDHL regulated tumor progression (p< 0.01), metastasis and once again confirmed the function of NSDHL. And high NSDHL expression in a total of 3951 breast cancer patients could be associated with lower recurrence free survival and we found that NSDHL is a clinically meaningful gene.

Conclusions In conclusion, we first identified the function of NSDHL gene in breast cancer to help the proliferation and metastasis of breast cancer cells and showed the possibility as a therapeutic target.

연구목적: 본 연구에서는 유방암 환자의 암 조직과 정상조직 및 혈액에서 전엑솜 서열 분석을 통해 발굴한 콜레스테롤 생합성에 관여하는 NSDHL 유전자의 발현을 유방암세포에서 조절한 후 세포실험과 동물실험에서 증식과 전이에 미치는 영향과 그 기전을 확인하여 임상적으로 적용 가능성이 있는 기초 연구를 진행하고자 하였다.

연구방법: 유방암세포에서의 NSDHL 유전자의 발현을 확인하기 위해 Western blotting, SYBRTM Green Real-Time PCR을 사용하였고, NSDHL 넉다운 세포를 형성하기 위해 Lipofectamine 2000TM을 사용하여 세포에 siRNA를 형질주입하였다. 그리고 세포 증식, 3D culture, 콜로니 형성, 세포주기, 전이, 침윤, 상처 치유 분석 및 콜레스테롤 분석 등 다양한 기능적 연구를 수행하였다. 또한 erlotinib을 처리하여 NSDHL 유전자의 표적 약물로서 치료에 효과적이라는 것을 확인하였다. 마지막으로 MDA-MB-231에 NSDHL의 shRNA를 형질도입시키고 NSG 마우스에서 NSDHL 능력을 확인하였다. 임상적으로 마이크로 어레이 유전자 발현 데이터와 Gene expression omnibus (GEO) 데이터베이스에 등록된 임상 데이터를 사용하여 이전의 연구에서 사용된 NSDHL 발현의 생존율에 대한 콕스 비례 위험률 모델 분석을 시행하였다. 연구결과: 정상 유방암세포 (MCF10A)보다 luminal A (MCF7)와 삼중 음성 유방암세포 (MDA-MB-231, BT-20)에서의 NSDHL mRNA와 단백질 발현이 모두 높게 나타났다. siRNA에 의한 NSDHL 발현 조절은 증식을 감소시키고 (p<0.01), 유방암세포에서의 분화 및 erlotinib에서의 민감성을 감소시켰다. 또한 NSDHL은 특히 MDA-MB-231 세포에서 TNBC의 이동과 침입을 억제했다 (p<0.01). 또한, NSDHL이 콜레스테롤 수치를 조절함을 알아냈다. 이를 우리는 생체 내 실험에서 NSDHL이 종양 진행 (p<0.01), 전이를 조절함을 관찰하면서 다시 한번 NSDHL 유전자의 기능을 확인하였다. 또한, 총 3951명의 유방암 환자에서 높은 NSDHL의 발현은 낮은 재발 생존율과 관련이 있을 수 있으며 임상적으로 의미 있는 유전자임을 확인하였다.

결론: 결론적으로, 유방암에서 NSDHL 유전자가 유방암 세포의 증식과 전이를 돕는 기능을 처음으로 밝히고, 이를 치료의 표적으로 사용할 수 있는 가능성을 보였다.