Development of de novo human hair microfollicle (hHMF) in vitro with primary cultured dermal papilla cells and outer root sheath cells

Abstract

인간 모낭의 발달은 배아 단계에서 mesenchymal-epithelial 사이의 복잡한 상호 작용의 결과이다. 최근 mesenchymal-epithelial interaction 메커니즘을 이용한 연구가 조직 공학 및 재생 의학 분야에 많이 응용되고 있다. 모낭의 재건 또한 mesenchymal-epithelial mechanism을 이용한 많은 연구가 시도되고 있지만 in vitro상에서 완전한 모낭의 재생은 여전히 어려움을 겪고 있다. 본 연구에서 우리는 모유두세포(DP)와 외모근초세포 (ORS) 인간의 두피에서 추출하였고 이를 이용하여 인간 미세 모낭 (hHMF)를 개발하였다. 배양된 DP 세포를 mesenchymal 세포로 사용하였고 ORS 세포를 epithelial 세포로 사용하여 mesenchymal-epithelial 상호작용을 유도하였고 3D hanging drop system(HD)에서 5일 동안 배양시켜 새로운 hHMF로 발달시켰다. 우리는 젊은 환자의 두피에서 간단하고 효과적인 방법으로 DP 및 ORS 세포를 추출하였고 면역 형광 염색을 통해 특이적 항체를 붙여 세포를 특정하였다. DP 세포와 ORS 세포는 우리가 확립한 특정 타임 라인에 따라 배양되었다. HD 배양에서 5일 간 배양한 후 hHMF의 발달이 관찰되었다. hHMF의 형태가 단일 방향 구조를 가지고 DP 구면이 모구 모양의 영역에 존재한다는 점에서 모낭과 유사했고 DP와 ORS 단일 세포들이 HD 배양을 통해 자발적으로 hHMF로 형성되는 것을 관찰 할 수 있었다. hHMF 또한 면역 형광 염색 분석을 통해 구조를 분석하였는데 특정 부위에 DP와 ORS 세포 마커의 발현을 관찰 할 수 있었다. 이 간단한 hHMF 발달 기술은 in vitro내에서 모낭 형성의 메커니즘을 입증할 잠재력을 제공할 것으로 기대된다. 또한, 우리가 설립한 방법에 새로운 성장인자 혹은 세포외기질을 추가하여 in vitro 상에서 완벽한 모낭이 형성 될 것이라 기대한다. 최종적으로, 진보된 배양 시스템을 통해 탈모 환자의 모발 관련 약물을 스크리닝 하거나 hHMF를 이용한 모발 이식이 가능해질 것이다. 우리 연구 결과는 조직 공학 및 모발 재생 연구에 새로운 통찰력을 가져올 것으로 기대된다.

The development of the human hair follicle (HF) is a consequence of the intricate interactions between mesenchyme and epithelium during the embryonic stage. Mesenchymal-epithelial interaction mechanism has been applied in tissue engineering and regenerative medicine researches recently. Although many studies have been attempted to reconstruct HF using mesenchymal-epithelial mechanism, the regeneration of the complete HF in vitro is still challenging. In this study, we extracted dermal papillae (DP) cells and outer root sheath (ORS) cells from human scalp and used them to develop into human hair microfollicles (hHMF). Cultured DP cells were used as mesenchymal cells and ORS cells were used as epithelial cells to induce mesenchymal-epithelial interactions and de novo hHMF were developed by incubation in 3D hanging drop (HD) culture for 5 days. We extracted DP and ORS cells with a simple and effective method from the scalp of young patients and characterized cells by attaching specific antibodies through immunofluorescence staining. DP cells and ORS cells were cultured according to specific timeline that we established. Spontaneous localization of the single cells was observed after 5 days of HD incubation. The morphology of hHMF resembled HF in that hHMF has uni-directional structure and the DP spheroid resides in the hair bulb-like area. Also, immunofluorescence analysis of hHMF showed the expression of specific DP and ORS cell markers in the specific site of structure. This efficient hHMF development technique provides a potential to demonstrate the mechanism of HF development in vitro. Finally, an advanced culture system will allow screening of hair-related drugs in patients with hair loss or hair implantation with hHMF. Our findings are expected to bring new insights into tissue engineering and hair regeneration research.