Use of yeasts with dsRNA virus-like particles for investigating the transcriptome-level effects of antivirals

Abstract

The emergence and re-emergence of virus-associated infectious diseases have significant influence on human health and society, and their control depends on both the efficiency and safety of antiviral drugs. There are around 90 chemicals have been formally licensed and prescribed for the treatment of viral infections. However, side effects of many antiviral drugs are largely unknown. Previous studies have focused on the effects of antiviral drugs on different viruses. While to understand the effects of antiviral drugs and to find their potential side effects, more studies should target on virus hosts, not only on viruses themselves. To fill in this research gap, this thesis aimed to characterize the effects of antiviral drugs (ribavirin and nitazoxanide) on virus host using Saccharomyces cerevisiae as a model organism due to its many advantages such as its complete genome is available and it shares many common genes and biological processes with human. The specific aims include: 1) to test the effectiveness of ribavirin and nitazoxanide on S. cerevisiae killer strain, a strain which can kill other sensitive strains (Chapter II)

2) to characterize the effects of ribavirin on whole transcriptomes of S. cerevisiae strains containing dsRNA virus-like particles (Chapter III)

and 3) to characterize effects of nitazoxanide on whole transcriptomes of S. cerevisiae strains containing dsRNA virus-like particles and S. cerevisiae cured strain (Chapter IV). The knowledge is scarce about the effects of ribavirin and nitazoxanide on eukaryotic organisms especially at their whole genome levels. This RNA-Seq-based study provides insights into how ribavirin and nitazoxanide impact on eukaryotic transcriptomes.

In Chapter I, background information of this thesis is presented. Particularly, a brief review of antivirals explained the necessity of more studies needed to clarify the safety and potential related mechanisms of the drugs. Literature survey of the two antiviral drugs used in this study (ribavirin and nitazoxanide) found that the related research areas are very active. Especially it was found that until now, there is no study utilizing RNA-Seq techniques to study the effects of ribavirin or nitazoxanide on the transcriptomes of the virus host. The powerful sequencing technique of RNA-Seq was utilized in this study as the main technique to detect the effects of antiviral drugs.

In Chapter II, the effectiveness of ribavirin and nitazoxanide on S. cerevisiae killer strain was tested. Two antivirals were used to cure the killer strain respectively, and the curing results were confirmed by halo assay and gel electrophoresis experiment. Moreover, to eliminate the possibility of contamination, interdelta PCR was also conducted. Results showed that both ribavirin and nitazoxanide were effective to cure the S. cerevisiae killer strain. Actually M dsRNA virus-like particles were removed from the killer strain and the killer strain also lost its killing character, indicating that the killer toxin was encoded in M dsRNA. Results of interdelta PCR also excluded the possibility of contamination. This chapter developed new methods to cure the killer strain of S. cerevisiae and provided a solid foundation for the following chapters, which aimed at characterizing the effects of the antiviral drugs utilizing S. cerevisiae as a model organism.

In Chapter III, based on the results of Chapter II, effects of ribavirin on whole transcriptomes of S. cerevisiae strains containing dsRNA virus-like particles were characterized by RNA-Seq. Three different strains, including S288C, S7 and MS300c were tested in this study. Ribavirin exposure experiment was conducted at two different time points, including 1 h and 4 h with the concentration of 100 μM of ribavirin for three different strains. Total RNA was extracted from samples exposed to ribavirin and the respective negative controls and proceeded to RNA sequencing. After RNA-Seq data analysis, I found small nuclear (sn)RNAs and small nucleolar (sno)RNAs in S. cerevisiae exposed to ribavirin were accumulated first and then reduced. Each snRNA or snoRNA molecule assembles with protein molecules to form a snRNP or a snoRNP, respectively. While small RNPs, including snRNPs and snoRNPs, are known to be associated with human diseases such as spinal muscular atrophy, dyskeratosis congenital, and Prader-Willi syndrome (Matera et. al. , 2007). Thus, there may be a need to scrutinize the relationships between side effects and small RNPs in patients who are treated with ribavirin.

In Chapter IV, based on the successful results and insightful hints obtained from Chapter III, another important potential broad-spectrum antiviral drug nitazoxanide was chose to study. Nitazoxanide is in clinical test for antiviral utilization and the potential side effects have not be known yet. Thus RNA-Seq was used to characterize effects of nitazoxanide on whole transcriptomes of S. cerevisiae strains containing dsRNA virus-like particles. Strains of S288C, S7, MS300c and cured strain obtained from Chapter II were tested. Nitazoxanide exposure experiment was conducted at two time-points 1 h and 4 h with the concentration of 10 μg/ml of nitazoxanide for four strains. RNA-Seq experiment condition was similar to Chapter III. Compared to the negative controls of each library, differentially expressed genes, enrichment GO terms and over (under)-representation of KEGG pathways were detected. Results showed that ribosome biogenesis function was largely influenced and ribosome assembly factors were significantly differentially expressed in S. cerevisiae strains exposed to nitazoxanide. Ribosome dysfunctions are known to be related with several important diseases such as male infertility, neurological defects and so on. This chapter provides insightful hints to the potential side effects of nitazoxanide and it might be significant since the drug is in clinical test now for reaching the antiviral medicine market.

In summary, this thesis utilized the powerful sequencing technique, RNA-Seq, to characterize the effects of antivirals on S. cerevisiae at the whole transcriptome level. This study is significant when considering ribavirins and nitazoxanides potential side effects related to dysregulation of small non-coding RNAs and ribosome biogenesis in humans who are treated for the viral infections by them, which is of great value for pharmaceutical and medical industry. In addition, it provided insights for ecological risk assessment that the similar defects may happen on other eukaryotes in the environment when antiviral drugs are released to the surroundings. Besides, this study developed the new and efficient method to screen important antiviral drugs to seek for their potential side effects and underlying reasons in the future.

바이러스성 질병의 출현은 사람의 건강과 사회에 중대한 영향을 끼쳐왔다. 이러한 바이러스의 위협에 대한 대처 방법으로써 효과적이며 안전한 항바이러스 제제의 개발과 사용이 필수적이다. 현재, 약 90 종의 항바이러스제가 바이러스 감염 치료를 위해 공식적으로 허가되어 사용되고 있다. 그러나 항바이러스제가 야기할 수 있는 부작용과 그 기전은 충분히 알려져 있지 않은 실정이다. 본 논문에서는 진핵 생물의 하나인 Saccaharomyces cerevisiae를 사용하여 항바이러스제로 사용되고 있는 Ribavirin과 Nitazoxanide가 진핵 생물에게 줄 수 있는 잠재적인 영향들을 전사체 수준에서 고찰하였다. 첫째, 2장에서 Ribavirin과 Nitazoxanide가 S. cerevisiae killer 균주에 미치는 영향을 확인하였다. 둘째, 3장에서 Ribavirin이 dsRNA virus-like particles를 가지고 있는 S. cerevisiae 균주의 전사체에 미치는 영향을 확인하였다. 셋째, 4장에서 Nitazoxanide가 dsRNA virus-like particles을 가지고 있는 S. cerevisiae 균주의 전사체와 S. cerevisiae cured 균주의 전사체에 미치는 영향을 확인하였다. 현재까지 Ribavirin과 Nitazoxanide가 진핵 생물, 특히, 전체 게놈 수준에서 미치는 영향은 자세하게 규명되어 있지 않다. 따라서, RNA 시퀀싱을 기반으로 한 이 연구는 Ribavirin과 Nitazoxanide가 진핵 생물 전사체에 미치는 영향에 대한 이해를 제공하며 이는 이 두 가지 항바이러스제의 부작용을 규명할 수 있을 것으로 판단된다.

제 1장에서는 이 논문의 배경 지식을 서술하였다. 또한, 항바이러스제의 안전성과 잠재적인 부작용에 대한 관련 기전을 명확하게 밝혀내기 위하여 더 많은 연구가 필요하다는 것을 설명하였다. 문헌 고찰을 통하여 이 연구에서 사용된 Ribavirin과 Nitazoxanide가 다른 연구자들에 의해 많이 연구 된것을 알 수 있었다. 하지만, Ribavirin과 Nitazoxanide가 바이러스에 감염된 숙주의 전사체에 미치는 영향에 대한 연구는 전무한 것을 확인하였다. S. cerevisiae는 선행 연구들을 통해 완벽한 게놈의 파악이 가능하고 인간과 생물학적 성질을 공유하는 등의 이점 때문에 이 연구에 사용하였다. RNA 시퀀싱은 항바이러스 제제의 영향을 파악하기 위하여 사용하였다.

제 2장에서는 S. cerevisiae killer 균주에 대해 Ribavirin과 Nitazoxanide의 효과를 시험하였다. 2개의 항바이러스 제제는 killer 균주를 치료하기 위해 사용되었고 그 결과는 halo 분석과 전기 영동 실험을 통해 확인하였다. 또한, 오염 가능성을 배제하기 위하여 interdelta PCR도 수행하였다. 그 결과, Ribavirin과 Nitazoxanide는 S. cerevisiae killer 균주를 치료하는데 효과적이었다. 실제로, M dsRNA virus-like particles이 killer 균주에서 제거되었다. 더불어, killer 균주가 다른 균주를 저해하는 성질을 잃어버렸고 이는 killer 균주가 가지고 있던 독소가 M dsRNA virus-like particles에서 유래한 것을 암시한다. Interdelta PCR의 결과를 통하여 오염 가능성도 배제하였다. 따라서 이 장에서는 S. cerevisiae killer 균주를 치료하는 새로운 방법을 개발하였으며 S. cerevisiae를 모델로 활용하여 항바이러스 제제의 효과를 입증하기 위한 기반을 확인하였다.

제 2장의 결과에 기반하여, 제 3장에서는 dsRNA virus-like particles를 가지고 있는 S. cerevisiae 균주의 전사체에 대한 Ribavirin의 영향을 분석하였다. 이를 위하여 세 가지 다른 S. cerevisiae 균주인 S288C, S7, MS300c가 사용되었다. Ribavirin 노출 실험은 100 uM의 Ribavirin을 1시간 혹은 4시간 동안 세 가지 균주에게 노출시키는 것으로 진행되었다. Ribavirin에 노출된 균주와 노출하지 않은 음성 대조군에서 RNA를 추출하여 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 그 결과로 소핵 RNA와 소핵소체 RNA가 Ribavirin에 노출된 직후 축적되었다가 줄어든 것을 확인하였다. 이 소핵 RNA와 소핵소체 RNA는 snRNP 또는 snoRNP를 형성하기 위해 단백질과 결합한다. snRNPs와 snRNPs를 포함한 작은 RNPs는 척수성 근위축증, 선천성 이상각화증, 프라더-윌리 증후군과 같은 인간 질병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, Ribavirin으로 치료받는 환자에게서 작은 RNPs와 부작용 사이의 관계를 면밀히 조사할 필요가 있다.

제 3장의 결과와 결론을 근거로 제 4장에서는 Nitazoxanide에 대해 연구하기로 결정하였다. Nitazoxanide는 항바이러스제로 사용하기 위해 임상 시험 중이며 잠재적인 부작용은 아직 알려지지 않았다. 따라서 RNA 시퀀싱을 사용하여 dsRNA virus-like particles를 가진 S. cerevisiae 균주와 S. cerevisiae cured 균주의 전사체에 대한 Nitazoxanide의 영향을 탐색하였다. 이를 위하여 S288C, S7, MS300c와 제 2장에서 Ribavirin으로 치료된 균주를 사용하였다. Nitazoxanide 노출 실험은 10 ug/ml의 Nitazoxanide를 4가지 균주에 1시간 혹은 4시간 동안 노출시키는 것으로 진행되었다. RNA 시퀀싱은 제 3장과 비슷한 조건으로 실행되었다. 각 균주의 RNA 시퀀싱 데이터를 음성 대조군과 비교하였을 때, Gene Ontology terms이 강력하게 발현되었고 KEGG pathway가 음성 대조군과 비교하여 억제되거나 촉진되었음을 확인하였다. 이 결과는 Nitazoxanide에 노출된 S. cerevisiae 균주에서 리보좀 발생 기능과 리보좀 결합에 관여하는 요인들이 크게 영향을 받았다는 것을 보여준다. 리보좀 기능 장애는 남성의 불임, 신경학적 결함 등과 같은 몇몇 중요한 질병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 정상 범주에서 벗어나게 촉진된 KEGG pathways는 S. cerevisiae의 세포들이 바이러스 복제와 확산에 대한 일종의 길항 반응으로 추정되나 추가적인 연구가 필요하다. 따라서 제 4장에서 확인된 Nitazoxanide의 잠재적인 부작용은 향후 Nitazoxanide가 항바이러스 제제로 사용되기 전 필수적으로 고려해야 하는 중요한 요인으로 여겨진다.

요약하면, 이 논문은 전사체 수준의 변화를 매우 효과적으로 탐지하는 기술인 RNA 시퀀싱을 사용하여S. cerevisiae에 대한 항바이러스 제제의 영향을 전사체 수준에서 기술하였고, 사람과 다른 진핵 생물에 대한 잠재적 부작용 및 그 영향에 관한 중요한 정보는 의약품 및 의료 산업에 큰 가치가 있다. 또한 환경 적 위험 평가를 위한 통찰력을 제공하여 항 바이러스제가 환경으로 방출 될 때 환경중의 다른 진핵 생물에도 유사한 결함이 발생할 수 있다. 게다가,이 연구는 중요한 항 바이러스 약품을 스크리닝하여 잠재적인 부작용을 찾는 새롭고 효율적인 방법을 제시하였다.