Insulin-mimetic and Neuroprotective Terpenoids from Gynostemma longipes and Camellia japonica

Abstract

Part 1

천연물은 새로운 당뇨치료제 개발에 있어서 유용한 자원이라 할 수 있으며 각지에서 과거로부터 민족의학적으로 유용하게 사용되어온 식물 중에서 과학적으로 기전과 효능이 평가되지 못한 식물이 많다. 약용식물로부터 당뇨치료를 위한 소재를 발굴하는 연구를 진행하는 가운데, 전통적으로 베트남에서 제 2형 당뇨병치료에 사용되어 왔던 Gynostemma longipes 잎의 95% EtOH 추출물이 2-NBDG를 사용한 assay에서 glucose uptake를 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였다. G. longipes의 생리활성과 화학성분에 대한 연구가 거의 되어 있지 않았기 때문에 본 연구는 항당뇨 생리활성을 나타내는 단일물질의 분리를 목적으로 수행되었다. Gynostemma longipes C.Y.Wu는 박과 (Cucurbitaceae) 에 속하는 다년생 덩굴성식물로서 베트남의 Ha Giang 지방의 허브농장에서 재배되어 수집되었다. 본 연구를 통하여 3,4-seco dammarane계열 3종 (1-3), hexanordammarane glycoside 계열 2종 (4-5), dammarane 계 glycoside 계열 5종 (6-10) 을 포함하여 총 10종의 신규물질을 분리하였으며 분리된 화합물의 구조는 UV, IR, NMR, MS/MS를 포함한 이화학적 및 분광학적 분석과 기존문헌들과의 비교를 통하여 동정하였다. 분리된 화합물 10종에 대하여 분화된 3T3-L1 adipocyte에서 2-NBDG를 사용한 glucose uptake에 미치는 활성을 평가하였을 때, 화합물 1, 2, 4 및 8이 Glucose transporter type 4 (GLUT4) 전위 (translocation)을 통하여 강한 glucose uptake 촉진효과를 보였다. 세포 내로의 2-NBDG uptake 촉진효과의 기전을 확인하기 위하여 glucose uptake 조절에 중요한 역할을 한다고 알려진 AMPK pathway에 미치는 활성을 검색하였을 때, 화합물 1, 2, 4, 8 및 10이 mouse C2C12 근관세포 (myotube)에서 인산화된 AMPK와 ACC의 발현을 상향조절하는 것을 확인하였다. 위 결과들은 당뇨병 치료제로서의 G. longipes의 전통적인 용례와도 일치함을 알 수 있다.

Part 2

Camellia japonica L. 은 차나무과 (Theaceae)에 속하는 상록수로서 한국, 중국, 일본에서 널리 자생하며 또한 재배되기도 한다. 전통적으로 C. japonica의 꽃봉오리는 상혈 (vomiting of blood), 출혈에 사용되었으며 강장, 항염증의 목적으로도 사용되어왔다. 본 연구는 파킨슨병의 rotenone model에서 신경보호효과를 검색하는 assay를 수행하였을 때 C. japonica 꽃의 70% EtOH 추출물이 강력한 신경보호효능을 나타내는 후보군으로 선정되었기에 본 활성을 나타내는 단일화합물 분리를 목적으로 실험을 수행하였으며 6종의 신규 3,4-seco-28-noroleanane 계열 triterpenoid (11-16) 를 분리하였다. 분리된 화합물의 구조는 UV, IR, NMR, MS/MS를 포함한 이화학적 및 분광학적 분석과 기존문헌들과의 비교를 통하여 동정하였다. 분리된 화합물에 대하여 신경보호활성을 평가하였을 때, 화합물 13-16이 human dopaminergic SH-SY5Y 세포에서 효과적으로 신경독성에 대한 보호효과를 나타내었다. 특히 화합물 15의 경우, α-synuclein 발현과 rotenone 처리에 의한 세포 내 활성산소발생을 억제함으로 강력한 세포보호활성을 나타내었다. 더욱이 이 화합물은 autophage marker로 알려진 microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3 (LC3)을 유도하며 rotenone 처리에 의해 유도된 염색체 응축을 감소시켰다. 위 결과들을 종합하였을 때, 본 연구를 통하여 파킨슨 질병의 치료제개발에 있어 유용한 후보물질을 제시하였다고 사료된다.

Part 1

Natural products are potential sources in the development of new classes for diabetes therapy. In the project of searching for antidiabetic substances from medicinal plants, a 95% ethanol fraction of Gynostemma longipes, an ethnomedicinal plant used to treat type 2 diabetes mellitus by local communities in Vietnam, was found to significantly increase glucose uptake using in vitro 2-NBDG assay. Gynostemma longipes (Cucurbitaceae family) was cultivated and collected in an herbal farm in the Ha Giang province of Vietnam. Recently, there are few studies on its chemical constituents and bioactivities. The chemical components of G. longipes are similar to species of Gynostemma genus which contain triterpenoids as major components. Therefore, the purpose of this research was performed the bioassay-guided fractionation and isolation of G. longipes. During this process, the purification of ten new triterpenes (110) were isolated, including three 3,4-seco dammarane (13), two hexanordammarane glycosides (4 and 5) and five other dammarane glycosides (610). All compounds were determined by the basis of spectroscopic analyses, including UV, IR, NMR, and MS/MS spectra. Isolated compounds (110) were then evaluated for their effect on glucose uptake in differentiated 3T3-L1 adipocyte cells using 2-NBDG, as a fluorescent-tagged glucose probe. Among them, compounds 1, 2, 4, and 8 showed particularly potent stimulatory effects through GLUT4 translocation. To investigate the underlying mechanism for the stimulation of 2-NBDG uptake into the cells by dammarane triterpenes from G. longipes, all isolates (110) were evaluated the stimulation effect on the AMPK pathway, which plays important role in glucose uptake regulation. It may be observed that compounds 1, 2, 4, 8, and 10 significantly up-regulated the expressions of phosphorylated AMPK and ACC in the mouse C2C12 myotubes. These results are consistent with ethnopharmacological report of G. longipes as a traditional medicine for treating diabetes.

Part 2

Camellia japonica (Theaceae family) is an evergreen tree which widely cultivated in Korea, China, and Japan. Since the ancient times, the flower buds of C. japonica has been used for treating vomiting of blood and bleeding, tonic, anti-inflammatory. During in vitro screening of medicinal plants for neuroprotective effects on rotenone model of Parkinsons disease (PD), a 70% ethanol extract from the flowers of C. japonica was found as a potential hit. Accordingly, the goal of this study was successfully isolation of six new 3,4-seco-28-nor-oleanane triterpenoids (1116) which based on bioassay-guided fractionation of this active extract. The molecular structures of these new triterpenoids were elucidated through extensive spectroscopic analyses, including UV, IR, high-resolution MS, NMR, and by spectral comparison with the published literature. Neuroprotective effect of isolated compounds was evaluated, and as a result, compounds 1316 effectively protected against neurotoxicity in the human dopaminergic SH-SY5Y cell line. Among them, compound 15 was found to exhibit the strongest neuroprotective effect by suppressing of α-synuclein expression and the intracellular production of reactive oxygen species (ROS) induced by rotenone treatment. Furthermore, this compound induced microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3), a commonly used autophagy marker, and also reduced the condensation of chromosome induced by rotenone treatment. In conclusion, it was demonstrated that a new class of chemical entities for developing bioactive compounds for PD therapy.