Soil Microbial Community and Functional Gene Response to Gamma Irradiation

Abstract

이온화방사선이 환경에 초래하는 영향에 대해 알아보기 위해서는 생태학적 접근이 필요하다. 그러나, 이온화방사선이 토양 생물군집에 주는 영향에 대해서 알려진 바가 많지 않다. 본 연구에서는 6주간 주당 24시간 동안 3가지 다른 농도(0.1 kGy/hr [저], 1 kGy/hr [중] and 3 kGy/hr [고])에서 토양을 60Co 감마선에 노출시켰다. 첫 번째 연구에서는 토양 내 DNA를 추출한 후 샷건 메타지놈 시퀀싱 (shotgun metagenome sequencing)을 하고 MG-RAST를 이용하여 분석했다. 방사선 노출이 증가할수록 분류학적 다양성과 기능적 다양성 모두 감소할 것으로 예상했다. 박테리아의 분류학적 다양성은 감소한 방면, 예상외로 균 및 조류의 다양성은 증가했는데, 아마도 경쟁으로부터 벗어나게 된 것이 이유로 추정된다. 박테리아 및 전체 생물군의 분류학적 다양성은 감소했으나, 박테리아, 균 및 전체 생물군의 기능적 유전자 다양성은 증가했다. 이는 스트레스 혹은 교란이 다양성을 증가시키는 효과가 있다는 것에 대한 새로운 예시로, 방사선 노출이 토양 생물로 하여금 기능적으로 더 광범위한 전략을 취하게 한다는 것을 암시한다. 반복적인 밀도 의존적 군집 생장의 붕괴 및 확장이 복권과 같은 효과 (lottery effect)를 주어 공존을 증진시키는 것일 수 있다. 방사선은 전반적인 군집 구성에 큰 변화를 주었다.

본 연구에서는 방사선에 내성이 있는 새로운 미생물 군을 제시한다: 전체 군집의 20%를 차지하는 Deinococcus-Thermus뿐 아니라 Chloroflexi (박테리아), Basidiomycota와 Chytridiomycota(균), 그리고 Nanoarcheota (고세균) 또한 방사성에 내성이 있는 것으로 보인다. 방사성 노출로 인해 바이러스와 전이인자 (transposon)의 상대적 빈도는 증가했는데, 방사능 스트레스를 받은 세포들의 저항성이 떨어졌기 때문으로 추측된다. 예상외로, 열 충격 (heat shock), 해독작용, 산(acid) 스트레스 및 저온 스트레스 등의 스트레스 관련 유전자의 상대적 빈도는 방사능 농도가 가장 높을 때 줄어들었다. 그러나, 휴면 관련 유전자(퍼시스터 세포 (persister cells), 포자의 탈수, 생성 및 생장 등)의 다양성 및 DNA 수리 관련 유전자는 예상대로 증가했다.

두 번째 연구는 Deinococcus (감마선에 저항성이 있다고 알려진 박테리아의 한 속(genus))의 생태적 특성에 초점을 맞추어 진행되었다. 6주간 방사선에 노출된 토양 내에서 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자의 시퀀스 데이터를 확보했고, 메타지놈 (metagenome) 데이터 및 기존에 발표된 Deinococcus의 전체 유전자 데이터를 이용하여 다음 물음에 대한 해답을 얻고자 했다: 1) 방사선 노출이 증가함에 따라 박테리아의 군집 구조는 어떻게 변화할 것인가? 그리고 Deinococcus에 속하는 다양한 종들이 방사선 농도에 따라 서로 다르게 우점할 것인가? 즉, 방사선에 따른 생태적 지위 (radiation niches)가 존재할 것인가? 2) 어떤 유전적 특징이 Deinococcus가 방사선이 높은 환경에서도 생존할 수 있게 하는가? 3) 방사선에 노출된 토양에서 Deinococcus는 어떤 영양학적 특징을 가지며, 이를 통해 방사선에 노출된 토양 내 생태적 과정들에 대해 알 수 있는 것은 무엇인가?

본 연구의 결과는 다음과 같다: 1) 방사선 노출 농도가 높을수록 Deinococcus의 상대적 빈도는 증가했으며, 가장 높은 농도에서는 상대적 빈도가 80%에 육박했다. 방사선 농도에 따라 우점하는 Deinococcus 종이 상이했는데, 이는 방사선에 따른 생태적 지위가 존재함을 나타낸다. 3 kGy/hr의 농도에선 D. ficus로 추정되는 단 하나의 조작분류단위 (OTU: operational taxonomic unit)가 우점했다. 2) 기존에 발표된 메타지놈 데이터에서도 D. ficus가 Deinococcus에 속하는 다른 종들보다 더 복잡한 유전적 구조를 가지며, DNA 및 뉴클레오티드(nucleotide) 대사, 세포벽, 세포막 신생, 세포 분열 조절, 세포 분열 및 염색체 분할 관련 유전자가 상대적으로 더 많았다고 보고되었다. 또한 GC 비율도 Deinococcus에 속하는 다른 종에 비해 높다. 이러한 특징들은 유전자의 안정성에 기여할 것으로 생각되고 명백히 경쟁도가 높다고 할 수 있는 방사선 노출이 심한 곳에서도 우점할 수 있는 근거를 제공한다. 3) 기존에 발표된 유전연구 데이터를 기반으로 할 때, D. ficus 등을 포함하는 Deinococcus 속이 방사선으로 인해 죽은 미생물 세포로부터 유래한 탄소공급원 (아라비노스 (arabinose), 젖당, 아세틸 글루코사민 (N-acetyl-D-glucosamine) 등 C5-C12를 포함하는 복합체)과 식물로부터 유래한 토양 유기물질들(셀룰로오스 (cellulose), 헤미셀룰로오스 (hemicelluloses) 등)을 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 4) 방사선 노출이 가장 심했던 토양에서도 토양시스템 내에서의 기본적인 기능과 관련한 유전자들 (리그닌 (lignin) 분해, 인 (P) 가용화, 질소 고정 등)이 비록 낮은 농도이지만 여전히 존재한다는 것을 메타지놈을 통해 알 수 있었다. 고농도로 방사선이 노출된 토양의 회복력 및 지속 가능성에 대한 연구, 다양한 토양 유형에서의 Deinococcus의 우점도 및 토양 내 기능 변화에 관한 연구도 후속연구 주제로 흥미로울 것으로 생각된다.

본 연구를 통해 감마선에 노출된 토양 생물군집의 기능적 유전자 및 분류학적 구성에 대해 알아볼 수 있었다. 본 연구는 토양 미생물 군집이 이온화감마선 (ionizing gamma irradiation)의 다양한 노출 농도에서 살아남을 수 있는 능력이 있다는 것을 보여주었다. 이는 감마선이 토양 또는 다른 중요 물질들의 멸균과정에 널리 이용되는 것에 대한 중요한 시각을 제공하고 오염된 환경에 대한 이해를 도우며, 우주여행에 대한 가능성 및 다른 행성에서의 지구생명체의 생존 가능성을 제시한다. 반복적인 주기로 토양을 감마선을 노출시킨 본 연구와는 달리 지속적으로 토양을 감마선에 노출시킨 연구, 실제 방사선으로 오염된 토양샘플을 대상으로 한 연구, 기타 다른 차세대시퀀싱 (NGS: next generation sequencing)기법들을 이용한 연구 등의 후속연구들이 등장할 것으로 기대된다. 이는 생물적 환경 정화 (bioremediation) 및 정책 형성에 기여하고 유용한 생물, 유전자, 및 생활성 (bioactive) 물질들에 대한 연구 및 개발에도 도움을 줄 것이다.

Ionizing radiation is a unique pollutant that requires novel ecological approaches and concepts to outline the resulting environmental outcome. However, little is known of the effects of ionizing radiation exposure on soil biota. Here, the soil was exposed to weekly 24-hour bursts of 60Co gamma radiation over a six-week period, at three levels of exposure (0.1 kGy/hr [low], 1 kGy/hr [medium] and 3 kGy/hr [high]). In the first study, soil DNA was extracted and shotgun metagenomes were sequenced and characterised using MG-RAST. It was hypothesized that with increasing radiation exposure there would be a decrease in both taxonomic and functional diversity. While bacterial diversity decreased, the diversity of fungi and algae unexpectedly increased, perhaps because of release from competition. Despite the decrease in diversity of bacteria and of biota overall, functional gene diversity of algae, bacteria, fungi and total biota increased. Thus, cycles of radiation exposure may increase the range of gene functional strategies viable in the soil, which is a novel ecological example of the effects of stressors or disturbance events promoting some aspects of diversity. Repeated density-independent population crashes followed by population expansion may allow lottery effects, promoting coexistence. Radiation exposure produced large overall changes in community composition.

The study suggests several novel radiation tolerant groups: in addition to Deinococcus-Thermus, which reached up to 20 % relative abundance, the phyla Chloroflexi (bacteria), Basidiomycota and Chytridiomycota (fungi) and Nanoarcheota (archaea) are suggested to include radiation-tolerant members. In addition, virus and transposon abundance increased, perhaps owing to reduced resistance by radiation-stressed cells. Unexpectedly, the relative abundance of stress-related genes decreased at higher radiation doses such as heat shock, detoxification, acid stress and cold shock related genes, but the diversity of dormancy (like persister cells, spore core dehydration, spore germination and sporulation cluster related genes) and DNA-repairs-related genes increased – as might be expected for selection for DNA repair mechanisms.

In the second study, attention was focussed on the ecology of Deinococcus – a genus of soil bacteria known for their radiation resistance, in the context of gamma radiation. The soil DNA was extracted following six weekly cycles of irradiated and studied using 16S rRNA amplicon data, annotated metagenome data and published whole genome for Deinococcus, to investigate the following questions: 1) How does the bacterial community structure change with increasing radiation exposure, and do different Deinococcus species dominate at different radiation intensities – suggesting the existence of radiation niches? 2) What features of the genomes of the Deinococcus species that predominate at higher radiation intensities confer greater success at high radiation exposures? 3) What are the overall trophic features of the Deinococcus assemblage in radiation-exposed soils, and what might this indicate about ecosystem processes in the irradiated soil?

It was observed that 1) increasing radiation dose produced a major increase in relative abundance of Deinococcus, which reached ~80 % of reads at the highest doses. Differing relative abundances of the various Deinococcus species with exposure levels indicate distinct radiation niches. At 3 kGy/hr, a single OTU identified as D. ficus overwhelmingly dominated the mesocosms. 2) Corresponding published genome data show that the dominant species at 3 kGy/hr, D. ficus, has a larger and more complex genome than other Deinococcus species with a greater proportion of genes related to DNA and nucleotide metabolism, cell wall, membrane and envelope biogenesis as well as more cell cycle control, cell division and chromosome partitioning related genes. It also has a higher guanine-cytosine ratio than most other Deinococcus. These features may be linked to genome stability, and explain its greater abundance in this apparently competitive system, under high radiation exposures. 3) Published genome analysis suggests that Deinococcus, including D. ficus, are capable of utilizing diverse carbon sources derived both from microbial cells killed by the radiation (including C5-C12 containing compounds like arabinose, lactose, N-acetyl-D-glucosamine) and plant-derived organic matter in the soil (e.g. cellulose and hemicellulose). 4) Overall, from its metagenome, even the most highly irradiated (3 kGy/hr) soil possesses a wide range of activities necessary for a functional soil system, such as lignin degradation, P solubilisation and N fixation – although at low abundances. Future studies may consider the resilience and sustainability of such soils in a high radiation environment. In addition to exploring, the extent to which species of Deinococcus dominate depending upon the soil type and the differences this might make to the soil functions.

The experimental frameworks of these studies enabled an assessment of functional gene and taxonomic composition of a gamma-irradiated soil community. These studies demonstrated the capacity of soil microbial community to remain viable under differing doses of ionizing gamma irradiation. This consideration is vital in view of the widespread application of gamma radiation to sterilize soil and other important materials, understanding contaminated environments, potential space travel and the viability of Earths lifeforms on other planets. To elaborate on these findings, future studies are anticipated to adopt continuous irradiation of soil as opposed to the repeated burst adopted for the present studies, include samples from actual irradiation contaminated sites and incorporate other next-generation sequencing techniques. Such studies will have greater implications for bioremediation, policy formulation, space exploration and harvesting of useful organisms, genes and bioactive compounds from irradiated soils.