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Production of porcine cloned embryos derived from cells conditionally expressing an exogenous gene using Cre-loxP : 돼지에서 Cre-loxP를 이용한 유전자 발현조절 배아생산에 관한 연구

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Authors

문준호

Advisor
장구
Major
수의학과
Issue Date
2012-02
Publisher
서울대학교 대학원
Description
학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 수의학과, 2012. 2. 장구.
Abstract
형질전환 모델 돼지를 만드는 과정에 있어서 조건부 유전자 발현의 필요성이 대두되고 있다. 본 연구에서는 이런 조건부 유전자 발현 시스템인 Cre-loxP 가 돼지의 태아세포에서도 작동을 하는지 여부와 이렇게 만들어진 세포가 핵이 제거된 난자 속에서 reprogramming되어 초기단계의 태아로 발달할 수 있는지 여부를 알아보았다. 본 연구를 위하여 수컷 태아 섬유아세포를 miniature pig로부터 분리하여 배양하였고, 형질전환을 위해 neomycin 저항 유전자가 floxed된 플라스미드인, pCALNL-DsRed를 transfection 하였다. 또한 2주간 750 ㎍/mL의 neomycin을 배양액에 첨가해 주어 형질전환된 세포를 선별하였다. 이렇게 형질전환된 세포는 형광현미경 하에서 아직 빨간형광단백질을 발현하지 않는다. 하지만 한시적으로 존재하는 플라스미드 형태의 Cre 유전자를 transfection해주고 나면 이 섬유아세포는 비로서 빨간형광단백질을 발현하기 시작한다. 이렇게 빨간형광단백질을 발현하는 세포를 somatic cell nuclear transfer (SCNT)의 donor cell로 사용하였다. 총 121개의 난자가 SCNT에 사용되었고, 그 중 76 (62.8%) 개 의 난자에서 난할이 일어났다. 모두 6개의 빨간형광단백질을 발현하는 배반포가 만들어졌다. Floxed되어 있던 neomycin 저항 유전자가 제거가 된 사실은 배반포에서 RT-PCR을 통해서 확인할 수 있었다. 결과적으로 본 연구에서는 Cre-loxP recombination이 miniature돼지의 섬유아세포에서도 정상적으로 작동한다는 사실과 이렇게 형질전환된 세포가 SCNT를 통해서 착상 전 태아발달 과정을 정상적으로 수행한다는 것을 확인하였다. 따라서 Cre-loxP에 의해 conditional 형질전환 복제 돼지의 생산이 가능하다는 사실을 확인하였다.
The necessity of conditional gene expression in pigs for making transgenic models is becoming evident. In this study, conditional expression of Cre-loxP in porcine fetal fibroblasts was investigated and the transformed fibroblasts were reprogrammed in enucleated oocytes to support further early embryonic development. Fetal fibroblasts from miniature pigs were used for transfection with pCALNL-DsRed including floxed neomycin resistant gene and selected with 750 ㎍/mL neomycin for two weeks. The transfected cells did not express red fluorescence under a inverted fluorescence microscope. After transient transfection of plasmid DNA expressing Cre, the fibroblasts began to express red fluorescence. The cells expressing red fluorescence were employed for somatic cell nuclear transfer (SCNT). A total of 121 oocytes were used for SCNT and 76 cloned embryos (62.8%) cleaved. Six blastocysts were developed after SCNT and expressed red fluorescence. Deletion of floxed neomycin resistant gene was confirmed by RT-PCR in cloned blastocysts. This study demonstrated that Cre-loxP recombination in miniature pig fibroblasts was successfully conducted and the sequentially transformed cells could develop into the pre-implantation embryo stage via SCNT.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/155107

http://dcollection.snu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000645
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