고열량 선호식의 섭취방법에 따른 백서 심리행동의 차등적 효과

Abstract

1. 목적 동물과 인간 모두가 선호도를 가지는 선호식의 섭취로 활성화되는 보상회로의 작용기전은 쾌감적인 행동을 하는 약물 중독 회로와 유사하다. 보상회로는 특히 심리행동에도 영향을 미치고, 또한 심리행동 장애는 스트레스 축의 기능 장애와 깊은 관련이 있다. 스트레스에 대응하여 체내의 항상성을 유지하도록 조절하는 기능은 주로 시상하부-뇌하수체-부신피질 축 (hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis, HPA axis) 즉 스트레스 축에서 담당한다. 활성화된 스트레스 축의 최종산물인 당질코르티코이드 (glucocorticoids)는 혈액에 분비되고, 다시 스트레스 축에서 음성되먹임 작용을 한다. 배쪽피개구역 (ventral tegmental area, VTA)에서 중격의지핵 (nucleus accumbens, NAcb)으로 도파민을 사출하는 변연계 도파민 회로는 동기부여, 보상, 행동을 담당하는 보상회로에서 중요한 역할을 한다. 선호식의 섭취에 의한 스트레스 축과 보상회로 도파민의 변화는 생리기전뿐만 아니라 심리행동에도 영향을 미친다. 이 전 연구를 통해 백서의 제한적 선호식 섭취는 스트레스에 대응 반응과 보상회로의 활성화를 둔화시킨다는 사실이 확인되었다. 본 연구에서 장기간에 걸친 선호식의 무제한적 섭취가 백서의 스트레스 대응 반응에 미치는 영향을 확인하였고, 선호식의 제한적 또는 무제한적 섭취의 차등적 효과를 백서의 심리행동과 분자수준에서 분석하였다.

2. 재료 및 방법 Sprague-Dawley 종의 수컷 백서 (270-300g)를 일반사료만 공급한 일반사료 공급군, 하루에 1 시간씩 Oreo 쿠키 공급과 사료를 자유공급하는 제한적 쿠키 공급군, 일반사료와 Oreo 쿠키를 함께 자유공급하는 무제한적 쿠키 공급군으로 나누었다. 각 군의 처치 상태를 1 주일간 유지한 후, 선호식의 무제한적 섭취가 스트레스 대응 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 구속스트레스에 노출시켰다 (n=6). 모든 군의 백서들은 스트레스 노출이 끝난 직 후 마취하여 심장관류법으로 뇌를 고정하였다. 스트레스 축의 활성화 정도를 확인하기 위하여 In situ hybridization방법으로 측뇌실핵 (paraventricular nucleus)의 부신피질자극호르문분비호르몬 (corticotropin-releasing hormone) mRNA 발현을 확인하였고, 구속 스트레스에 노출된 2시간 동안 4개의 시간구역 (0, 20, 60, 120 분)에서 백서의 꼬리 혈액을 채취하여 corticosterone을 조사하였다 (n=6). 보상회로의 활성화를 확인하기 위하여 면역조직화학법으로 중격의지핵 (nucleus accumbens)의 c-Fos 발현을 분석하였고, 도파민회로의 활성화를 확인하기 위하여 In situ hybridization방법으로 배쪽피개구역의 타이로신수산화효소 (tyrosine hydroxylase) mRNA 를 분석하였다. 선호식의 제한적 섭취와 무제한적 섭취가 심리행동에 미치는 영향을 알아보기 위하여 쿠키를 공급하고 1 주일 후 행동실험; 8 일 째 ambulatory activity test, 10일 째 elevated plus maze, 14 일 째 forced swim test를 진행하였고 (n=6), 보상회로의 분자기전을 확인하기 위하여 western blot analysis로 중격의지핵의 brain derived neurotrophic factor (BDNF)와 phosphorylated cAMP response element binding protein (pCREB), 배쪽피개구역의 BDNF를 관찰하였고, 선호식 중독을 확인하기 위하여 면역조직화학법으로 중격의지핵의 ΔFosB를 확인하였다.

3. 결과 고열량 선호식의 무제한적 섭취가 스트레스 축에 미치는 영향을 분석한 결과 측뇌실핵의 부신피질자극호르몬분비호르몬 mRNA 발현에서 일반사료 공급군은 스트레스를 받았을 때 정상적으로 증가하였으나 무제한적 쿠키 공급군에서는 스트레스에 의한 변화가 확인되지 않았다. 구속스트레스를 받는 120 분간 4 개의 시간구역에서 혈장 corticosterone 양을 측정한 결과 일반사료 대조군은 20 분에서만 유의하게 증가하였지만 무제한적 쿠키 공급군에서는 20, 60 분에서 유의한 증가가 관찰되었다. 보상회로의 신경원 활성화를 분석한 결과 일반사료 공급군은 중격의지핵껍질 (NAcb-shell) 지역에서 스트레스에 의한 c-Fos 활성 신경원이 증가하였으나, 무제한적 쿠키 공급군은 변화가 관찰되지 않았다. 도파민회로의 활성화 정도를 확인하기 위하여 in situ hybridization 방법으로 배쪽피개구역의 TH mRNA를 분석한 결과 일반사료 대조군은 스트레스에 대응하여 정상적으로 증가하였지만 무제한적 쿠키 공급군은 스트레스에 의한 유의한 차이를 나타내지 않았다. 일반사료 공급군, 제한적 쿠키 공급군, 무제한적 쿠키 공급군으로 나누어 각 군의 심리행동을 확인하기 위하여 행동실험을 진행한 결과, 무제한적 쿠키 공급군이 ambulatory activity가 증가하는 경향을 나타내었다. 불안장애 관련행동을 확인하기 위하여 central zone activity, sterotypy를 확인한 결과, 제한적 쿠키 공급군이 일반사료 대조군과 비교하여 유의성은 없지만 number of entry into center가 증가하는 경향을 보였고, 제한적 쿠키 공급군은 대조군에 비하여 rearing 수의 증가 경향, grooming의 수의 감소를 나타내었으며, defecatin activity는 제한적 쿠키 공급군에서 증가, 무제한적 쿠키 공급군에서 감소하는 경향을 나타내었다. 불안장애 행동의 일반적인 지표인 elevated plus maze test를 실행한 결과, 각 군 간의 차이는 보이지 않았으며, 우울증 행동의 지표인 forced swim test 결과, 무제한적 쿠키 공급군이 대조군에 비하여 immobility가 증가하였다. 선호식의 섭취방법에 따라 다르게 자극된 보상회로를 분자수준에서 분석한 결과, 중격의지핵의 ΔFosB는 쿠키 공급군 모두에서 증가하는 경향을 보였으며, BDNF는 제한적 쿠키 공급군에서 증가, 무제한적 쿠키 공급군에서 감소하는 경향을 보였다. 중격의지핵의 pCREB과 배쪽피개구역의 BDNF는 차이를 나타내지 않았다.

4. 결론 백서의 장기간 고열량 선호식의 무제한적 섭취는 스트레스에 대응한 스트레스 축의 활성화를 증폭시키고, 도파민 보상회로 활성화를 억제하였다. 장기간의 제한적인 선호식의 섭취는 불안장애관련 행동을, 무제한적 섭취는 우울증관련 행동장애와 불안장애 행동을 확인하였다. 섭취방법에 따른 심리행동의 차이는 섭취방법에 따라 다른 양상을 나타내는 BDNF가 관여할 것이라 사료되었다.

1. Objective The mechanisms of activated reward pathway by high caloric palatable food ingestion which is preferred both human and animals are similar to drug addiction pathway that has hedonic behaviors. The reward pathway especially affects psychological behavior, and the disorder of psychological behavior is deeply related to the dysfuction of HPA axis. The function which arranges homeostasis of the interior of the body to maintain against stress is normally in charge of hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis (HPA axis). Glucocorticoids secretion in blood, the result of the activation of HPA axis, operates negative feedback. Also, the mesolimbic dopaminergic pathway which emits from ventral tegmental area (VTA) to nucleus accumbens (NAcb) is in charge of the essential position in reward pathway for motivation, reward, and behavior. The dysfuction of stress-induced HPA axis and dopamine of reward pathway by ingestion of palatable food does not only affect the physiology but also the psychology. We have already reported that limited access to palatable food decreases stress-induced activation of HPA axis and reward pathway in rat. In this study, we are confirmed the effects of the stress-induced response by long-term free ingestion of palatable food, the gradual effect that affects psych-emotional behaviors by limited or free ingestion, and its neural mechanisms.

2.Materials and Methods After Male Sprague-Dawley rats (270-300g) were habituated, the rats were divided into following 3 groups and treated for 1 week in each group; Chow only group was given only ad libitum chow, Limited Cookie group was given ad libitum chow and daily 1 hour limited access to oreo cookie, and Free Cookie group was allowed unlimited chow and oreo cookie. After 1 week, rats were exposed to restraint stress in order to check the effect stress-induced stress response by free access to cookie. Rats in all groups were anesthetized immediately after done to expose against stress, and then the brains were fixed by transcardiac perfusion with 4 % paraformaldehyde. In order to check the activation of HPA axis, brains were processed for in situ hybridization in order to examine corticotrophin-releasing hormone (CRH) mRNA in PVN and plasma glucocoticoids was examined by collecting blood from tails of rats for two hours when rats had been exposed to restraint stress at four-time points (0, 20, 60, and 120 minute). The expression of c-Fos in NAcb was analyzed by Immunohistochemitry to check the activation of reward pathway and TH mRNA in VTA was analyzed by In situ hybridization to check the activation of dopamine pathway. We performed behavior test; ambulatory activity test (on 8th day), elevated plus maze (on 10th day) and porsolt swim test (on 14th day) (n=6) to confirm the psycho-emotional effect of limited and free access to cookie. BDNF, pCREB in NAcb or VTA were conducted by western blot analysis and ΔFosB in NAcb was confirmed by immunohistochemistry to examine the molecular mechanism.

3.Results In the results that analyze how the limited ingestion of palatable food affects HPA axis, it was normally increased stress-induced corticotrophin-releasing hormone mRNA expression in PVN but in Free Cookie group, the change was not confirmed. The amount of plasma corticosterone level at four time points during restraint stress for 120 minutes was significantly increased at the 20-minute in the Chow only group. However, it was significantly increased at the 20 and 60-minute in the Free Cookie group. Stress-induced c-Fos-activated nuclei in NAcb shell were increased in Chow only group but Free Cookie group didnt show any change against stress. TH mRNA expression in VTA by the in situ hybridization in order to check the activation of dopamine pathway was normally increased in Chow only group against stress. However, the Free Cookie group didnt show the any significance against stress. As the result of the behavior experiment in the 3 groups, free access to palatable food tended to increase activity compared to Chow only and Limited Cookie, but the frequency was prone to increase going to the center in Limited Cookie group. In the Limited Cookie group compared to the others, the amount of rearing tended to increase and grooming was decreased. Limited Cookie group increased and Free cookie group tend to decrease the activity of defecation. In elevated plus maze test, there are not big differences between groups, and as the result of porsolt swim test, immobility of Free Cookie group was increased compared to the Chow only group. As a result of differentially activated reward pathway according to amount of ingestion of palatable food, ΔFosB in the NAcb tended to increase both cookie groups and BDNF was prone to increase in the Limited and decrease in Free Cookie group. There is no difference of pCREB and BDNF in NAcb and VTA, respectively.

4.Conclusion Long-term free ingestion of high caloric palatable food amplifies the stress-induced HPA axis activation and blunts stress-induced dopaminergic reward pathway activation. The intermittent access to palatable food causes anxiety-like behavior and free access causes depression-like behavior and anxiety-like behavior at the same time. Psycho-emotional behaviors that had different patterns according to amounts of ingestion of cookie were related to BDNF.