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Studies on genetic diversity and characterization of cellulolytic enzymes from anaerobic rumen fungi : 반추위 혐기곰팡이 섬유소분해효소의 유전적 다양성과 특성에 관한 연구

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Authors

송재용

Advisor
하종규
Major
농생명공학부
Issue Date
2012-02
Publisher
서울대학교 대학원
Abstract
반추동물은 박테리아, 프로토조아 그리고 곰팡이 등 다양한 미생물의 도움으로, 섭취한 사료를 분해하여 에너지의 형태로 전환시킨다. 이러한 미생물 중 반추위 혐기곰팡이는 단일 균체에 섬유소 분해효소 및 단백질 분해효소를 분비하는 복합효소체계를 가지고 있다. 최근 섬유소 분해 효소는 바이오 에너지 생산과 관련하여 재조명되고 있으며, 생물정보학 및 차세대 염기서열분석 기술의 발전에 따라 새로운 효소의 발견에 가속화를 이루게 되었다. 본 연구에서는 반추위 혐기곰팡이가 생산하는 새로운 섬유소 분해 효소를 찾아내고, 각 효소의 염기서열의 상동성과 그 효소적 특성을 비교 분석하였다.

1. 반추위 혐기곰팡이 Neocallimastix frontalis PMA02의 탄수화물 대사회로내의 기능성 유전자 분석
본 연구는 N. frontalis PMA02의 탄수화물 대사회로 내의 기능성 유전자를 expressed sequence tagging 방법을 통하여 알아보고자 실시하였다. 총 10,080개의 clone에 대한 염기서열을 분석한 결과 평균 크기 628bp에 대한 염기서열의 정보를 얻었으며, 중복되는 지점을 연결함으로써 1410개의 contig에 대한 정보와 1360개의 singleton에 대한 정보를 획득하였다. Public data base를 이용하여 염기서열을 분석한 결과 1192개의 clone이 기능이 보고된 염기서열과 일치하였으며, 이중 693개 clone의 염기서열이 곰팡이에서 유래한 단백질과 일치하였다. 기능이 밝혀진 clone 중 154 개의 서열이 생물대사에 관여하는 유전자였고, 328개 clone의 염기서열이 세포구성에 관여하는 유전자였다. 또한 탄수화물의 대사과정에 관여하는 대부분의 효소단백질에 대한 정보를 EST 분석을 통하여 얻을 수 있었다. Hemicellulase인 mannanase, xylose isomerase, xylan esterase 와 xylanase와 β-glucosidases 5종, cellulase 10종이 검출되었다. 본 연구는 N.frontalis 의 탄수화물 분해에 대한 복합 효소 체계를 보고하는 최초의 연구로, 이후 혐기곰팡이의 섬유소 분해 효소 연구에 기초자료로 이용될 것으로 기대된다.

2. 반추위 혐기곰팡이 Neocallimastic frontalis PMA02에서 분리한 Aacetyl xylan esterase1 의 발현 및 특성에 관한 연구
본 연구는 N.frontalis 의 EST 서열 분석에서 분리한 acetyl xylan esterase1(AXE1)의 단백질 발현과 효소 특성을 알아보고자 실시하였다. 발현된 AXE1 단백질은 분자량이 37.3 kDa이며, anaerobic fungus Opinomyces 속 과 Neocallimastric patricicum 에서 분리된 AXEA, bnaI 유전자와 각각 73%, 55.6%의 염기서열 상동성을 갖는다. Aacetyl xylan esterase 1은 pET28b 벡터에 삽입되어 E.coli BL21 (DE3) 에서 발현되었다. Aacetyl xylan esterase 1은 28.1%의 효율로 정제되었으며, 효소역가는 495.2 U mg-1로 정제 전 보다 123.3 배로 증가하였다. Aacetyl xylan esterase 1은 p-nitrophenyl acetate, α-naphthyl acetate, acetylated birchwood xylan과 acetylated beechwood xylan를 분해할 수 있었으며, 반응 적정온도와 pH는 각각 40oC and pH8 이었다. 또한 AXE1과xylanase를 acetylated birchwood xylan에 효소반응 한 경우, xylanase만 단일 반응한 경우에 비해 약 25%의 상보효과를 보였다.

3. 한국 재래산양에서 분리한 반추위 혐기곰팡이의 형태적, 대사적 그리고 유전자적 특성 비교
본 연구는 한국 재래산양에 존재하는 반추위 혐기 곰팡이를 분리하고, 각 곰팡이의 형태적, 대사적, 유전자적 특성을 비교하고자 실시하였다. 반추위 누관이 장착된 4마리의 재래산양에서 총 37개의 혐기 곰팡이를 sigmacell, starch, CMC, filterpaper 와 각 4개의 복합 기질을 탄소원으로 이용하여 분리하였다. 분리된 곰팡이는 모두 filamentous 형 가근과 monocentric 형 엽상체가 관찰되었다. 분리된 곰팡이는 형태적 관찰과 ITS1 서열분석을 통해 O25, O27과 O29는 Piromyces 속으로 나머지는 Neocallimastix 속으로 분류되었다. 형태적 분석과 대사유전자의 서열분석을 통한 비교 분석에서는, 각 곰팡이의 특징을 구분지을 명확한 차이를 찾을 수 없었다. 그러나 ITS1 서열 분석에 따라 분리된 곰팡이는 총 9개의 Neocallimastix 속과 1개의 Piromyces속으로 구분할 수 있었다. 특히 Piromyces속으로 분류된 곰팡이의 성장 속도, CMCase와 xylanase의 역가가 Neocallimastix 속보다 상대적으로 낮았다. 이렇게 분류된 곰팡이중 총 7개를 선발하여 이후 연구에 적용하였다.

4. 한국 재래산양에서 분리한 반추위 혐기곰팡이의 섬유소 분해효소의 유전적 다양성에 관한 연구
본 연구는 섬유소 분해능력을 근거로 선발된 반추위 혐기곰팡이의 cDNA libray를 구축하고, 효소반응을 기초로 기능성 유전자를 분리, 비교하고자 실시하였다. Neocallimastix 속 6종(G8, G9, G51, G52, G64 and O7) 과 1종의Piromyces속 (O25)의 cDNA library를 구축하였으며, 각 곰팡이 별로 평균 2.1kb 크기의 cDNA가 삽입된 60,000 개의phage를 선발에 이용하였다. 효소 반응에 근거한 선발을 통해 선발된 151개의 clone 에 대한 염기서열을 분석한 결과 Cel45A 그룹이 가장 많이 포함되어 있었으며, 특히cellobiohydrolase는Piromyces속에서만 분석되었다. 혐기곰팡이의 섬유소 분해 유전자 와의상동성 분석에서는 80% 이하가 10개가 있었으며, 선발된 유전자간에는 최고 약 40%의 염기서열 상동성을 갖는 것으로 분석되었다.

5. 한국 재래산양에서 분리한 반추위 혐기곰팡이의 섬유소 분해효소의 발현 및 특성에 관한 연구
본 연구는 섬유소 분해능력을 근거로 선발된 섬유소 분해 효소 유전자의 단백질 발현과 효소 특성을 알아보고자 실시하였다. 각 섬유소 분해 유전자는 pYES2/CT 벡터에 삽입되어Saccharomyces cerevisiae INVSC1에서 발현되었다. 발현된 단백질은 분자량이 43.22kDa 부터 89.37 kDa 으로 다양하였다. 각 섬유소 분해 단백질은 GH 5, GH 6, GH 9 와 GH 45 네 개의 glycosylhydrolase family로 분류되었다. Public data base를 이용하여 아미노산 서열을 분석한 결과 ① O25-7-2, ② O25-13-4, ③ O25-2-2, ④ G8-15, ⑤ G9-9, ⑥ G64-17, ⑦ G7-33와⑧ O7-56는 각각 ① Piromyces 속의 exocellobiohydrolase (81%), ② Piromyces 속의endoglucanase Cel9B(88%), ③ Piromyces 속의endoglucanase 5A(91%),④Piromyces 속의endoglucanase Cel9B(82%), ⑤ Ralstoniasolanacearum의 endoglucanase(46%), ⑥ Orpinomyces속의 glucanohydrolase(69%), ⑦ Piromyces 속의 endoglucanase 45A(82%), ⑧ Rhizopusoryzae의 endo-beta-1,4-D-glucanase(65%)로 분석되었다. 반응 적정 pH는 pH5에서pH 9까지, 적정 온도는 40oC 에서 60oC 까지로 다양하게 분석되었다. 특히 O7-33, O7-56 와 O25-7-2는 80 oC 에서 1시간 처리 후에도 약 40% 정도의 섬유소 분해 능력을 가지고 있어 열 안정성이 우수한 것으로 판단된다.

본 연구의 결과는 반추위 혐기곰팡이의 탄수화물 대사회로에 관련된 기능성 유전자 연구와 섬유소 분해 효소 관련연구의 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 기대한다. 또한 본 연구를 통해 획득한 섬유소 분해 효소들은 안전성과 대량배양에 대한 시험이 수행될 경우, 사료 및 바이오 에너지를 비롯한 효소 관련 산업에 적용이 가능할 것으로 판단된다.
The ruminant animals acquire most of their energy from the fermentation products of feed digested by anaerobic bacteria, protozoa and fungi. The rumen anaerobic fungi secrete various cellulolytic enzymes through their multiple enzyme system. Due to increase in bio-energy production using bio-mass, interests in cellulolytic enzymes are increasing. In addition, development in bioinformatics tools and Next Generation Sequencing technology, the discovery of novel cellulolytic enzymes from anaerobic fungi are much easier than ever. In this study, unknown cellulolytic enzyme, and to analyze genetic diversity and characteristics of enzymes were performed.

1. Analysis of Functional Genes Involved in Carbohydrate Metabolism from Anaerobic Rumen Fungus Neocallimastix frontalis PMA02
The purpose of this study was to isolate functional genes related with carbohydrate metabolism from anaerobic rumen fungus N. frontalis using high throughput Expressed Sequence Tagging method. From 10,080 acquired clones, 9,569 clones with average size of 628 bp were selected for analysis. After assembling process, 1,410 contigs were assembled and 1,369 sequences were remained as singletons. The 1,192 sequences were matched with proteins in public data base with known function and 693 of them were matched with proteins isolated from fungi. 154 sequences were classified as the genes related with biological process and 328 sequences were classified as the genes related with cellular components. Most of enzymes in the pathway of glucose metabolism were successfully isolated via construction of 10,080 ESTs. Four kinds of hemi-cellulase were isolated such as mannanase, xylose isomerase, xylan esterase, and xylanase were isolated. Five β-glucosidases with at least three different conserved domain structures were isolated. Ten cellulases with at least five different conserved domain structures were isolated. This is the first solid data supporting the expression of multiple enzyme system in fungus N. frontalisfor polysaccharide hydrolysis.

2. Molecular Cloning, Heterologous Expression, and Characterization of Acetyl Xylan Esterase1 from Anaerobic Rumen Fungus Neocallimastic frontalis PMA02
The purpose of this study was to express and characterize the AXE1 acquired from EST analysis of the rumen anaerobic fungus N. frontlis PMA 02. The deduced amino acid sequences consisted of mature protein with an estimated molecular mass of 37.3 kDa with 4.5 pI. The high sequence homologies were obtained with AXEA and BnaI of anaerobic fungus Opinomyces spp. and N. patricicum, respectively but not with those of any other aerobic microbes. The cloned gene was heterologously expressed as recombinant protein in E.coli BL21 (DE3). After partial purification, 121.3- fold activity with a yield of 28.1% and the specific activity of 495.2 U mg-1 were acquired. The partially purified recombinant protein displays broad substrate specificity as acetate being released not only from p-nitrophenyl acetate but also from α-naphthyl acetate, acetylated birchwoodxylan and acetylated beechwoodxylan. Temperature and pH optima were 40oC and pH 8 respectively when assed with p-nitrophenyl acetate as a substrate. In addition, synergistic effect was also observed when co-incubated with xylanase for the degradation of acetylated birchwoodxylan.

3. Comparison of Morphologic, Metabolic and Genetic Characteristics of Anaerobic Rumen Fungi Isolated From Korean Native Goat
The purpose of this study was to compare of the morphology, metabolic end-product and genetic characteristics of anaerobic rumen fungi isolated from Korean native goat. The isolated anaerobic rumen fungi were cultivated in anaerobic condition at 39℃ with modified Lowes medium containing each filter paper, starch, carboxymethylcellulose(CMC), sigmacell and mixture of 4 substrates(G) as carbon source. All of the isolated fungi were observed filamentous rhizoid and monocentric thallus. From the results of morphological and ITS1 gene analyses, colonies O25, O27 and O29 were identified as genus Piromyces genus and the other 34 colonies were identified as genus Neocallimastix. According to phylogenetic analysis based on ITS1 analysis, isolated 37 fungi were separated into 10 groups. The growth rate and fibrolytic enzyme activities of genus Piromycesgenus were the lower than those of genus Neocallimastix.

4. Genetic Diversity of cellulolytic Enzymes in Anaerobic Rumen Fungi Isolated from Korean Native Goat
The purpose of this study was to discover noble cellulolytic enzyme genes from anaerobic rumen fungi isolated from Korean native goat using meta-transcriptome methods. The cDNA library for 6 Neocallimastix genus (G8, G9, G51, G52, G64 and O7) and one Piromyces genus (O25) were constructed. Six thousandphages which containing average 2.1kb of fungal cDNA were screened based on cellulytic activities. One hundred and fifty one phages were selected and cDNA sequences were analyzed. Endo-glucanase Cel45A were detected with the highest number from selected genes, particularly cellobiohydrolase were analyzed only from the genus Piromyces. In the NCBI blast test, genes which showed below 80% similarity were 10. The about 40% similarity was detected in selected genes.

5. Cloning and Characteristics of Cellulolytic Enzymes from Anaerobic Rumen Fungi in Saccharomyces cerevisiae.
The purpose of this study was to express and characterize the cellulolytic enzymes acquired from cDNA library of the rumen anaerobic fungus isolated Korea native goat. Each 8 cellulolytic genes were cloned into pYES2/CT vector and expressed as recombinant protein in Saccharomyces cerevisiae INVSC1. The deduced amino acid sequences consisted of mature protein with an estimated molecular mass of 43.22 kDa to 89.37 kDa. Cellulolytic genes were classified with 4 glycosyl-hydrolase family as GH 5, GH 6, GH 9 and GH 45. According to blastP, 8 cellulolytic genes were analyzed as follows : O25-7-2 ; Piromyce ssp. exocellobiohydrolase (81%), O25-13-4 ; Piromyce ssp. endoglucanase Cel9B(88%),O25-2-2 ; Piromyce ssp. endoglucanase 5A(91%), G8-15 ; Piromyce ssp. endoglucanase Cel9B(82%),G9-9 ; Ralstonia solanacearum endoglucanase (46%), G64-17 ; Orpinomyce ssp. Glucanohydrolase (69%),G7-33 ; Piromyce ssp. endoglucanase 45A(82%), O7-5 ; Rhizopuso ryzae endoglucanase (65%). Optimal pHs and temperatures were distributed widely from pH 5 to pH 9 and 40oCto 60oC. Especially, heat stability of O7-33, O7-56 and O25-7-2 was better than other expressed cellulolytic enzymes because of remained activity of this 3 enzymes were about 40% after incubation at 80oC for 1hr.
The results of this study could be used in functional genomics and cellulolytic enzyme research for metabolic pathway of carbohydrate fermentation in anaerobic rumen fungi. Also, if the problem of stability and mass culture is resolved, heterologous cellulolytic enzymes acquired in this study might be applied to feed, bio-energy and enzyme industry.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/156300

http://dcollection.snu.ac.kr:80/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000001469
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