명암주기 조작에 의한 지속적인 일주기 교란이 일주기 행동과 생리에 미치는 영향

Abstract

생체의 일주기성 리듬은 낯과 밤의 변화에 따른 외부환경시계와 음성피드백으로 조절되는 내재적 분자생체시계가 서로 조화를 이루어 조절된다. 교대근무나 잦은 시차적응과 같이 외부의 시계가 내재적 시계와 적절한 동기화를 이루지 못하는 현상을 생체시계 교란이라 한다. 이와 같은 현상이 지속되는 경우 행동, 섭식, 수면 장애 및 대사증후군 등을 많은 병리학적 변화를 수반되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 그 위험요소가 어디에서 유래하는 가에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있으며 단순히 생체리듬이 망가져서 오는 것으로만 간주되어 왔다. 본 연구에서는 정상쥐(WT, wild type)와 생체시계가 망가진 쥐(PDK, Per1/2 Double Knock-out)를 세가지 빛 주기 (정상24시간, 짧은 8시간, 긴 36시간)에서 사육하면서 장기적으로 나타나는 행동/체온리듬, 섭식, 몸무게의 변화 그리고 사망률을 측정한다. 측정된 값을 바탕으로 이원분석법(Two-way ANOVA)이용해 빛 주기, 생체시계 그리고 둘 간의 상호작용이 생리조절에 미치는 결과를 알아보고 조절요소가 어디에서 유래하는지를 분석해 보았다. WT 쥐에서는 행동과 체온의 24시간 리듬이 장기적이고 비정상적인 외부 빛 자극에 의해 서서히 리듬을 잃어버리는 현상을 보였으며 PDK 쥐는 주기와 관계없이 외부의 빛 조건에 빠르게 적응하는 양상을 보였다. 행동력과 체온의 진폭 등은 WT 쥐에서만 유의미적인 감소를 관찰할 수 있어 빛 주기와 생체시계가 상호작용을 통해 행동과 체온의 일주기성 리듬을 조절하는 것을 알 수 있었다. 빛 주기 조절에 의한 자극을 중단하고 지속적인 밤에 위치해본 결과 지속적인 빛 주기 교란을 받는 동안에는 24시간 리듬을 유지하고 않고 있었다. 그러나 4-5일 후에 그 리듬이 회복되는 것을 보아 빛 주기에 의해 영구적인 손상을 받지는 않는 것으로 사료된다. 흥미롭게도 섭식량과 몸무게의 변화는 WT과 PDK 쥐에서 공통적으로 나타남을 발견할 수 있었다. 이는 생체시계교란에 의한 공통적으로 일관된 변화를 일으키는 것이 아니라 빛 주기와 생체시계가 상호작용 없이 독립적으로 생리현상을 조절할 수 있음을 보여준다. WT 쥐의 짧은 빛 주기에 의해서 사망률이 증가되었으나 PDK 쥐는 빛 주기에 영향을 받지는 않는 현상이 관찰되었다. 이 결과는 짧은 빛 주기가 생체시계와의 상호작용을 통하여 건강에 치명적으로 작용함을 알 수 있다. 본 연구의 결론으로, 빛 자극에 의해서 유발되는 생체시계 교란은 여러 가지 생리적/병리적 변화는 수반하게 되는데, 이는 리듬이 망가져서 오는 공통적인 변화로 생각되어져 왔다. 그러나 본 연구에서는 빛에 의한 조절, 생체시계에 의한 조절 그리고 둘 간의 상호작용에 의한 조절이 각각 혹은 결합되어 나타나는 복합적 결과임을 증명하고 있다. 또한 생체시계교란이 공통적인 생리적 변화를 초래하지 않는다는 본 연구의 결과는 교대근무와 같은 생체시계 교란 조건에서 발견되는 많은 병리학적 변화가 적절한 빛 조절을 통해 완화될 수 있음을 시사한다. 인광효소(luciferase)를 이용한 실시간 프로모터 활성도 모니터링 기술은 24시간 주기의 생체시계 조절기전을 연구하는데 획기적인 기술을 제공하여 왔다. 그러나 한번에 한가지 채널만을 탐색할 수 있어 생체시계와 같은 복잡한 시스템을 연구하는 데는 제한 점이 있어왔다. 최근 새롭게 발견된 Emerald (Eluc, 초록색) 와 RED (Rluc, 빨간색) 인광효소는 자연상태에서 같은 기질(substrate)를 사용함에도 불구하고 다른 색상의 빛을 내는 것으로 보고된 바 있다. 이를 활용하여 빛의 파장을 filter를 통해 구분하고 이를 바탕으로 서로 다른 프로모터의 활성도를 동시에 측정하는 방법을 고안하고 생체시계 연구에 응용해보고자 하였다. Eluc 과 Rluc 은 green filter (540nm)와 red filter (620nm) 에서 각기 다른 투과율을 보였으며 각각의 활성을 수식을 통하여 명확히 구분할 수 있었다. 또한 이과정에서 각각의 유전자 활성이 지나치게 치우칠 경우 파장대가 겹친다는 인광효소의 단점으로 인해 해상도가 영향을 받을 수 있으며 이는 발현조절을 통해 해결될 수 있음을 증명하였다. 또한 유전자의 활성을 동시에 볼 수 없었던 Per2 와 Bmal1 의 유전자의 활성도를 동시에 측정하였고 서로 상반된 위상을 가지고 있음을 증명하였다. 생체시계 유전자를 본 이종색상 인공효소 시스템 (Dual color luciferase system) 에 적용하여 본 결과 각각의 유전자가 Per2 혹은 Bmal1 에 특징적으로 작용하여 생체시계의 24시간 유지에 중요한 역할을 함을 증명하였다. 본 연구는 색상이 다른 두가 종류의 luciferase 를 이용하여 각기 다른 유전자의 활성도 조절을 동시에 측정하는 기술을 확립할 수 있었다. 이 기술을 활용하여 생체시계 뿐만 아니라 다양한 유전자들의 시간적인 조절양상을 동시에 측정할 수 있을 것으로 기대된다.

The circadian rhythm is an endogenous clock which can be entrained by environmental light-dark (LD) cycle. The periodicity of internal clock is not exact 24 hour and the phase of the oscillation should be tuned by environmental resetting cues. Light information, a prominent cue for this resetting, is transmitted to SCN via retino-hypothalamic tract (RHT) and synchronized the endogenous clock with environmental LD cycle. Therefore, the circadian rhythm is a harmonized result of environmental LD cycle and endogenous clock. Circadian disturbance is defined as a condition of desynchronization between endogenous clock and environmental LD cycle and known to cause adverse physiological changes including mortality. However, it is yet unclear whether these consequences result from disturbance of endogenous clock or condition of the LD cycle per se. To address this issue, I first monitored wheel running and body temperature rhythms of wild-type (WT) and functional clock defective (PDK, Period1 and 2 double knock-out, Per1-/-Per2-/-) mice under three different periods of LD cycle (T): normal (T=24 h, L:D=12 h:12 h), shortened (T=8 h, L:D=4 h:4 h) and lengthened (T=36 h, L:D=18 h:18 h). As expected, PDK mice rapidly adjusted their overt rhythms to exotic T cycles, whereas WT mice gradually failed to sustain their circadian rhythmicity as the non-24 h T cycles persisted. In WT mice, the shortened T cycle caused a chronic 8 hr phase shift repeated every ~15 days with concurrent decreases in locomotor activity and rhythms amplitude, while a lengthened T cycle reduced the locomotor activity without affecting its amplitude. In the absence of a functional clock, total activity was significantly reduced compared with that of clock-intact mice but this decrease was independent of cycle length. I then evaluated the life-long effects of the altered T cycles on body weight, food intake and longevity. Body weight and food intake were independently affected by genotype and the T cycles, while the life span of the animals was affected by their interaction resulting increased mortality of wild type mice in a shortened T cycle. These results strongly indicate the presence of both separate and combined effects of the endogenous clock and T cycles on different physiological variables. Moreover, the unshared results of various T cycle manipulations imply that adverse effects of circadian disturbance, such as shift-works, can be relieved by LD scheduling. Another set of experiments was designed to develop a novel tool which monitors anti-phasic oscillation of Per2 and Bmal1 gene expression simultaneously. Real-time monitoring system by luciferase has advanced our understanding of temporal events of biological processes. However, the expression pattern of more than one gene cannot be simultaneously monitored due to the lack of the method for distinguishing each luciferase signal. Here, I report that two promoter activities can be simultaneously monitored by using two different red (Red luciferase, Rluc) and green (Emerald Luciferase, Eluc) colored luciferases. Rluc and Eluc had a maximum spectral wavelength at 536 and 605nm, respectively. To distinguish the activities of each promoter, I calculated the transmittance rate of each luciferase using >620nm long pass filters which exhibit best resolution and made a mathematical equation which differentiate the each activity of luciferase in mixed expression condition. In this model system, I demonstrated that the anti-phasic oscillation of Per2 and Bmal1 promoter activity can be simultaneously monitored by using different colors of luciferases. This novel approach enables us to simultaneously monitor rhythmic oscillation of two sets of gene expressions in an one-step reaction providing us a useful tool for molecular circadian rhythm.