The role of telomerase reverse transcriptase on the increased glutamatergic neuronal differentiation in the prenatal valproate exposure model of autism spectrum disorder in rats

Abstract

Autism spectrum disorder (ASD) is a kind of pervasive developmental disorder, and characterized by three main behavioral features including social deficits, impaired communication, and stereotyped and repetitive behaviors. The brain of ASD patients has been characterized with specific features including macrocephaly, imbalanced signal between excitation and inhibition, synaptic abnormalities and so on. Among these features, imbalanced excitatory/inhibitory signal in the autistic brain has been recently magnified as a main cause of ASD symptoms. However, mechanism governing the increased excitatory synaptic activity is unclear yet. Because excitatory/inhibitory imbalance in brain can be induced by aberration in glutamatergic/GABAergic neuronal differentiation, the mechanism of excess excitatory neuronal differentiation was investigated in an animal model of ASD induced by prenatal valproate (VPA) exposure, which may produce symptoms like autistic disorders including skeletal malformation, neural tube defects, and several behavioral abnormalities both in human and rodents. Although exposure to VPA at E9.5 showed strong reproductive toxicity, VPA exposure at E12 showed no major reproductive toxicity but most significant changes in behaviors over control animals with reduced sociability and social preference as well as increased sensitivity to electroshock convulsion. In addition to the altered social behavior, VPA exposure induced increased glutamatergic neuronal differentiation in postnatal brains as exemplified by immunostaining and Western blot using specific marker proteins including PSD-95. Similar finding was observed with primary neural progenitor cell culture treated with VPA in vitro. Expression of transcription factors, which has been implicated in glutamatergic neuronal differentiation, i.e., Pax6, Ngn2, and NeuroD1 was increased in VPA-exposed embryonic brains as well as neural progenitor culture in vitro. When we silenced the expression of Pax6 using siRNA transfection in cultured rat primary neural progenitor cells, VPA induced neither expression of Ngn2 and NeuroD1 nor glutamatergic hyper-differentiation suggesting the essential role of Pax6 induction in this process. The expression of telomerase reverse transcriptase (TERT), that elongates telomere and recently known as a transcription factor interacting with Brg1, was increased by VPA. The binding of TERT protein on Pax6 gene promoter was demonstrated by chromatin immunoprecipitation using anti-TERT antibody, which suggests the possible role of TERT in inducing Pax6 expression. Silence of TERT expression using siRNA transfection in vitro inhibited VPA-induced expression of Pax6, Ngn2 and NeuroD1 as well as excess glutamatergic differentiation. Over-expression of TERT protein using hTERT-GFP plasmid transfection in vitro activated glutamatergic neuronal differentiation by inducing expression of Pax6, Ngn2 and NeuroD1. These results suggest that glutamatergic neuronal differentiation is increased in the VPA-induced autistic animal model and TERT over-expression induces sequential increase of Pax6, Ngn2 and NeuroD1 leading to the increased excitatory neuronal maturation. The results from the present study may provide further insights into the molecular basis of increased excitability observed in autistic individuals.

자폐 범주성 장애는 전반적 발달장애의 일종으로, 세 가지 주요 행동학적 증상인 사회성 부재, 의사소툥능력의 부재, 제한적이고 반복적인 행동 양상을 특징으로 한다. 자폐증 환자의 뇌는 대두증, 흥분성 신호와 억제성 신호 간의 불균형, 시냅스 형성 이상 등과 같은 특징을 보인다. 이러한 특징 중에서, 뇌 내 신호 불균형은 최근에 자폐성 행동의 주요 원인으로 대두되고 있다. 흥분성 신호전달을 증가시키는 기전은 아직 명확하지 않지만, 이러한 뇌 내의 흥분성/억제성 불균형은 흥분성 신경세포와 억제성 신경세포의 분화 이상으로 인해 야기될 수 있으며, 본 연구에서는 선천성 발프로산 노출을 통해 유도한 자폐증 동물 모델을 사용하여 과도한 흥분성 신경 분화 기전을 연구하였다. 선천성 발프로산 노출은 사람과 설치류에서 골격계 형성의 이상, 신경관 결손과 더불어 자폐증 증상와 깊게 관련된 여러 행동학적 이상을 야기하며, 이를 통해 자폐증의 동물 모델로 널리 사용되고 있다. 임신 9.5일 발프로산 노출은 높은 생식독성을 보였으나, 임신 12일에 발프로산에 노출된 흰쥐는 과도한 생식독성이 유발되지 않은 상태에서, 대조군에 비해 사회성 및 처음 접하는 흰쥐에 대한 호기심이 크게 감소하며, 전기자극으로 유도한 간질에 보다 민감함을 나타내는 등 사람의 자폐증과 유사한 증상을 나타내었다. 사회적 행동 양상 변화와 더불어, 발프로산 노출은 흥분성 신경세포 분화를 증가시켰으며, 이를 표지자인 PSD-95 등을 이용한 면역화학적 염색과 Western blot을 통해 관찰하였다. 흰쥐 일차 배양 신경줄기세포에 발프로산을 in vitro 처치하였을 경우에도 유사한 결과를 관찰하였다. 흥분성 신경세포 분화에 관여하는 것으로 알려진 전사인자인 Pax6, Ngn2 및 NeuroD1의 발현이 임신 중 발프로산에 노출된 흰쥐 배아 뇌조직과 in vitro 경로를 통해 발프로산에 노출된 신경줄기세포에서 모두 증가되었다. 흰쥐 일차 배양 신경줄기세포에서 siRNA를 이용하여 Pax6의 발현을 억제하였을 때, 발프로산에 의한 Ngn2, NeuroD1의 발현 증가 및 과도한 흥분성 신경세포 분화가 일어나지 않았다. 이를 통해 발프로산에 의한 흥분성 신경세포 분화 증가에 있어서 Pax6가 중요한 역할을 수행함을 확인하였다. 텔로머라아제 역전사효소의 발현 또한 발프로산 노출에 의해 증가하는데, 텔로머라아제 역전사효소의 일반적인 역할은 세포 분열 시 짧아지는 텔로미어의 길이를 늘리는 것이다. 하지만 최근에, 염색질 개조 단백질의 일종인 Brg1과 직접 결합하여 전사인자로서 역할을 수행함이 새롭게 밝혀졌다. 이에 기반하여, 텔로머라아제 역전사효소가 전사인자로서 Pax6의 발현을 직접적으로 증가시키는지에 대해 연구하였다. 텔로머라아제 역전사효소는 Pax6 유전자에 직접 결합하여 Pax6 mRNA 및 단백질의 발현을 증가시키고 흥분성 신경세포로의 분화를 증가시킨다. 흰쥐 일차 배양 신경줄기세포에서 siRNA를 이용하여 텔로머라아제 역전사효소의 발현을 억제하였을 때, 발프로산에 의한 Pax6, Ngn2, NeuroD1의 발현 증가와 과도한 흥분성 신경세포 분화가 감소함을 관찰하였다. 녹색 형광 단백이 붙은 사람 유래 텔로머라아제 역전사효소 플라스미드를 이용해 텔로머라아제 역전사효소 단백질의 발현을 증가시킨 결과, Pax6, Ngn2, NeuroD1 발현 증가를 통해 흥분성 신경세포로의 분화가 증가함을 관찰하였다. 이러한 결과를 종합했을 때, 발프로산으로 유도한 자폐증 동물 모델에서 흥분성 신경세포로의 분화가 증가되어 있으며, 과발현된 텔로머라아제 역전사효소는 Pax6, Ngn2, NeuroD1 전사인자들의 순차적인 발현 증가를 일으켜 흥분성 신경세포 과생성을 유도함을 알 수 있다. 이는 자폐증 환자에서 나타나는 흥분성 관련 사회적 이상 행동의 분자생물학적 이해를 돕는데 크게 기여할 것으로 사료된다.