Improvement of Purification efficiency by site-directed mutagenesis in interferon beta mutein fusion antibody

Abstract

Interferon β is attracting attention as an anticancer drug because it can induce the death of cancer cells. However, low stability of interferon β, induction of systemic toxicity after administration, and resistance of cancer cells are limiting the use of interferon β as an anticancer agent. In the previous study, we have developed rhIFNβ-1a, which induces additional glycosylation of its 25 amino acid by substituting Threonine for arginine, the 27th amino acid of recombinant human interferon β 1a (rhIFNβ-1a) and named R27T. We also developed a fusion protein of R27T that was fused to the anti-ERBB-2 therapeutic antibody, Trastuzumab. In addition, Trastuzumab-C17S-R27T, in which amino acid cysteine at position 17 of rhIFNβ-1a was replaced with serine, was developed to further improve physical properties and efficacy. This study was conducted to compare the purification efficiency and biological properties of Trastuzumab-R27T and Trastuzumab-C17S-R27T in the purification using affinity chromatography and ion exchange chromatography. The interferon bioactivity, immunomodulatory effect, anticancer efficacy, ability to bind to HER2, and ADCC efficacy were also compared. Trastuzumab-C17S-R27T showed improved purification efficiency and decreased aggregation in terms of physical properties when compared with Trastuzumab -R27T. It also confirmed that anti-cancer effect, interferon bioactivity and immunomodulatory efficacy were the same. In addition, the ability to bind HER2, and ADCC efficacy, was similar to Trastuzumab-R27T.

Therefore, Trastuzumab-C17S-R27T, which replaced cysteine with Serine, was found to be a more effective anticancer drug than Trastuzumab-R27T.

인터페론 베타는 암세포의 사멸을 유도할 수 있어 항암제로 관심을 받고 있다. 그러나 인터페론 베타는 낮은 단백질 안정성과 투여 후 전신독성의 유발, 암세포의 저항성은 인터페론 베타를 항암제로 사용하는데 있어서 제한되고 있다. 이를 극복하기 위해서 항체와 융합단백질을 만드는 시도가 이루어지고 있다. 선행연구에서 본 연구그룹은 80번 아미노산에 N-glycosylation을 가지고 있는 재조합 인간 인터페론 베타1a(rhIFNβ-1a)의 27번 아미노산인 Arginine을 Threonine으로 치환하여 25번 아미노산에 추가적인 Glycosylation을 유도한 rhIFNβ-1a을 개발하였고 R27T로 명명하였으며, 이를 다시 항-ERBB-2 치료용 항체인 Trastuzumab에 융합시킨 융합단백질에 관한 개발연구를 진행하였다. 여기에 추가로 물성과 정제 효율성을 개선하기 위하여 융합단백질의 rhIFNβ-1a 부위의 17번 아미노산인 Cysteine을 Serine으로 치환한 Trastuzumab-C17S-R27T를 연구개발 하였다. 본 연구는 Protein A와 Ion exchange를 이용한 정제에서 Trastuzumab-R27T와 Trastuzumab-C17S-R27T의 정제 효율과 생물 활성을 비교 분석하였으며, 다양한 암세포주에서 Trastuzumab-R27T와 Trastuzumab-C17S-R27T의 인터페론 생물 활성과 Immunomodulatory 효능, 항암 효능, HER2에 결합하는 능력, ADCC 효능 등을 확인하였다. Trastuzumab-C17S-R27T는 Trastuzumab-R27T와 비교하였을 때, 정제 효율이 향상되었고, 항암 효과 및 인터페론 생물 활성과 Immunomodulatory 효능에서도 동등함을 확인하였다. 추가로 HER2에 결합하는 능력, ADCC 효능들도 Trastuzumab-R27T와 동등하게 나타났다. 따라서 Cysteine을 Serine으로 치환한 Trastuzumab-C17S-R27T는 기존 Trastuzumab-R27T를 대체하여 더욱 효율적인 항암제로서의 활용 가치가 확인되었다.