Antitumor effect of CDK4/6 inhibitor, palbociclib, in acquired lapatinib resistant HER2-positive breast cancer cells

Abstract

Background: Lapatinib is a dual tyrosine kinase inhibitor which interrupts the HER2/neu and epidermal growth factor receptor (EGFR) family pathways in solid tumors. It is used for the treatment of patients with advanced or metastatic breast cancer whose tumors overexpress HER2. Majority of patients who initially respond to the treatment will eventually progress due to acquired resistance. The defect in cell cycle regulation via increased levels of cyclin D-CDK4/6 complexes is a well-known mechanism of the acquired resistance to lapatinib. Thus, CDK4/6 inhibition can be considered as an attractive strategy to overcome lapatinib resistance. In this study, antitumor effect of palbociclib, a CDK4/6 inhibitor was investigated whether it can be used as a new strategy to treat lapatinib resistant cells by modulating cell cycle regulation. Methods: Acquired lapatinib resistant SK-BR-3 cells are established by treating lapatinib consistently for 7 months. The characteristics of lapatinib resistance (LR) cell lines were evaluated by MTT, FACS, Western blotting, qPCR, methylation assay and transcriptome analysis. The antitumor effects of palbociclib in SK-BR-3 LR cell lines were evaluated through changes in proliferative ability using MTT and colony forming assay. Mechanism of action was analyzed by BrdU assay, β-galactosidase assay, Western blotting assay for signal transduction molecules and IFA. Results: In SK-BR-3 LR cells, the change of the molecules that were related to the G1/S transition of cell cycle was prominent. It was confirmed that cell cycle progression and proliferation were significantly faster in SK-BR-3 LR cells compared to parental cells. Overexpression of cyclin D1 and CDK6 was shown in SK-BR-3 LR cells but cyclin-dependent kinase inhibitor, p16 and p14 were suppressed. Cyclin D1 and CDK6 were upregulated at the transcription level, and the epigenetic suppression of CDKN2A was observed. Palbociclib inhibited the cell cycle progression and reduced the cell viability significantly in SK-BR-3 LR cells by cell cycle arrest via blocking hyper-phosphorylation of Rb. Palbociclib also induced autophagic cell death in SK-BR-3 LR cells but not in SK-BR-3 parental cells. Furthermore, palbociclib showed antitumor activity against HER2 targeted therapy resistant patient derived xenograft (PDX) with CDKN2A defect and cyclin D1 upregulation. Conclusion: The changes of cell cycle molecules that were related to G1/S transition was observed in SK-BR-3 LR cells. Deficiency in CDKN2A and upregulation of cyclin D1 led to the increased cell cycle progression and proliferation in SK-BR-3 LR cells. CDK4/6 inhibitor palbociclib showed antitumor effect in SK-BR-3 LR cells through modulating cell cycle in vitro and in HER2-directed therapy resistant PDX model. These results suggest that inhibition of cyclin D1 by palbociclib could be an effective strategy for treating lapatinib resistance.

Lapatinib은 HER2와 epidermal growth factor receptor (EGFR)을 차단하는 이중 tyrosine kinase 억제제로써 HER2 양성 전이성 유방암에서 효과적으로 작용하나 치료 중 내성이 나타난다. Cyclin D-CDK4/6 복합체의 과도한 활성으로 인한 무분별한 세포주기 활성은 lapatinib에 대한 획득 내성 기전으로 알려져 있다. 따라서 lapatinib 내성을 극복하기 위한 전략으로 cyclin D-CDK4/6 경로를 활용할 수 있을 것으로 판단하였다. 본 연구에서는 CDK4/6 억제제인 palbociclib이 세포주기를 조절하여 lapatinib 내성 세포에서 항종양효과를 나타내는지 확인하고, 그 기전을 연구하여 lapatinib 내성 HER2 양성 유방암의 새로운 치료 전략으로 사용될 수 있는지 연구하였다. HER2 양성 유방암 세포주 SK-BR-3에 lapatinib의 농도를 증가시키면서 장기간 처리하여 내성이 생긴 세포주를 수립하고 transcriptome data, FACS, Western blotting, qPCR, methylation assay 등을 통해 lapatinib 내성 세포주의 특성을 확인하였다. MTT, BrdU assay와 콜로니 형성 분석의 변화를 통해 palbociclib의 세포 증식억제 효과를 관찰하였고, 세포 주기에 관여하는 분자와 신호 전달경로에 관여하는 분자들의 발현 변화 및 β-galactosidase assay와 IFA를 통해 기전을 연구하였다.

Lapatinib 내성 세포에서는 세포주기의 G1/S 이행과 관련된 분자들의 변화가 두드러지게 나타났으며 SK-BR-3 부모 세포와 비교하여 세포주기의 진행과 증식 속도가 증가되어 있었다. 이와 관련하여 lapatinib에 대한 내성 기전 중 하나인 cyclin D-CDK4/6 복합체의 활성이 증가하고 이들을 억제하는 CKI인 CDKN2A가 메틸화로 인해 억제되어 있었다. Cyclin D1과 CDK6 발현은 전사수준에서 증가 되었고 CDKN2A는 후성 유전 억제나 이 결과를 통해 CDKN2A의 억제로 인해 cyclin D1의 활성화가 유발되었다고 판단하였다. Palbociclib은 Rb의 인산화를 억제하여 lapatinib 내성 HER2 양성 유방암 세포주에서 세포주기 진행을 억제하고 세포 생존 능력을 현저하게 감소시킨다는 것을 확인하였으며 palbociclib이 lapatinib 내성 세포에서 자가소화작용을 유발하여 세포성장 억제 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. HER2 표적 치료제에 내성이 생겨 CDKN2A의 억제와 cyclin D1의 증가가 일어난 HER2 양성 유방암 환자로부터 얻은 환자유래 종양 동물 모델에서도 palbociclib이 효과적으로 종양의 성장을 억제함을 확인하였다. 따라서 palbociclib에 의한 세포 주기 경로의 억제는 lapatinib 내성 HER2 양성 유방암 치료에 효과적인 전략이 될 수 있으며 본 연구 결과를 통해 palbociclib이 호르몬 수용체 양성 유방암뿐만 아니라 다른 아형에서도 적용이 가능하다는 것을 보여주었고 환자유래 종양 동물 모델에서 검증하여 빠른 임상 적용을 할 수 있을 것이라 기대할 수 있다.