반송 구화의 발달 형태 및 위치에 따른 유전적 변이와 전사체 비교

Abstract

Pinus densiflora f. multicaulis Uyeki is one of the unique varieties of pine trees and is distributed mainly in Korea and Japan. Unlike the pine tree, the trunk is not developed straightly, but several branches are separated from the beginning of the ground. Thus, various types of tree appear for each individual, and they have excellent value. P. densiflora f. multicaulis are rarely distributed in nature and propagate by combining them for commercial or research purposes. In addition, Pinus species have been reported to have bisexual strobilus mixed male and female organ, and the development of bisexual strobilus has been observed more frequently in other species than in other species. and recently some transcriptome analysis has been conducted in two overseas species. Also, studies on the reasons for the development of bisexual strobili in the pine trees and the factors determining the reproductive organs have been continuously carried out. In Korea, the genome sequencing project of Pinus densiflora is in the beginning stage, and genetic research on P. densiflora f. multicaulis is also in the basic stage. In this study, we selected P. densiflora f. multicaulis Uyeki that have a low height and a lot of strobili, and analyzed the characteristics of the strobili and mature cones of P. densiflora f. multicaulis by the morphological, transcriptomical and genetical variances differences. As a result of the analysis of cones and seeds, the on P. densiflora f. multicaulis showed a developmental pattern of sex transformation consistent with the results of the other species of pine trees. As a result of morphological analysis of the cones and seeds developed at the apical and lateral sides, it was found that side cones and seeds from the side cones had lower germination times and growth than the cones and seeds developed at the apical them. However, it was confirmed that the seeds obtained from the side cones were close to the germination rate of the seeds obtained from the apical cones. As a result of analysis of transcriptome, the LEA gene family, cyplp029 gene, WRKY transcription factor ZmWRKY17, and dhn_ESK2 and so on were expressed in male strobili. In the beginning of biosexual strobili, we identified PtLTP1 to control ethylene, PIN1 to transport Auxin and NPF7 which transports nitrogen respectively. In female strobili, gibberellin, which is always expressed specifically in female tissues, the precursors of hormones such as CYPs and gibberellin metabolism genes, which are involved in the biosynthesis of gibberellin and brassinosteroid, in addition, in female strobili of side part, LINE-1 retrotransposable element was identified. As a result of the SNPs comparative analysis of normal population only developed apical cones and abnormal population developed side cones, only 16,666 SNPs were found in the two groups. Homo / homo SNPs 92, all of which matched within the population and differ between groups, were selected. Mapping to the sequence and RNA-seq data of the reference genome at the selected SNPs site revealed the transposon PpRT1 of Pinus pinaster. The function of the sequence of the selected SNPs should be clarified through further studies. From the results of this study, it was found that the same cone as the apical of branch is also developed in the lateral of branches. And genes that are presumed to be expressed by the flower developmental structure of P. densiflora f. multicaulis can be selected. In addition, we could find genetic differences according to the location of female strobili. Future studies such as the functional study of the genes found in this study and the development of the markers according to the results of SNPs molecular markers will be necessary.

반송(Pinus densiflora f. multicaulis Uyeki)은 소나무의 독특한 품종 중 하나로써 한국과 일본에 주로 분포한다. 소나무와 달리 줄기가 곧게 발달하지 않고 지상부에서부터 세 개 이상 다수의 수간이 갈라져 나온다. 그리하여 개체 별로 다양한 수형이 나타나 관상적 가치가 뛰어나다. 반송은 자연에 집단분포하는 경우가 극히 드물며 상업적 또는 연구적인 목적으로 접목하여 증식해왔다. 더불어 소나무속 수종들은 암구화와 수구화가 혼합되어 있는 양성구화가 발생한다고 보고되어 왔으며, 반송에서는 양성구화의 발달이 다른 수종보다 많은 것이 관찰되어왔다. 최근에 들어서야 해외에서 소나무종의 두 가지 수종에서 전사체 분석이 진행되었다. 그리고 소나무속에서 양성구화가 발생하는 이유나 생식기관을 결정하는 요인에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 국내에서는 소나무(Pinus densiflora)의 유전체 해독 프로젝트가 시작하는 단계에 있으며, 반송에 대한 유전적인 연구 또한 기초단계에 있다. 본 연구에서는 소나무 속에서 수고가 낮고 구화가 많이 발달하는 반송을 선정하여 반송의 구화 및 성숙구과의 특성을 형태학적, 전사학적 그리고 유전학적인 차이를 비교 분석하였다. 구과와 종자 분석 결과, 반송이 기존 소나무 속의 타수종 연구 결과와 동일한 성전환하는 양성구화의 발달 형태를 보였다. 그리고 정단부와 측면부에서 발달한 구과 및 종자를 형태학적으로 비교 분석한 결과, 측면부에서 발생한 구과와 측면부 구과에서 생산된 종자가 정단부에서 발달한 구과 및 종자와 비교하여 발아하는 시기와 생장이 저조하다는 것이 밝혀졌다. 그러나 시간이 지나면 측면부에서 얻은 종자가 정단부에서 얻은 종자의 발아율에 가까워지는 것을 확인할 수 있었다. 구화들의 전사체 분석 결과, 수구화에는 LEA gene family와 cyplp029 gene, WRKY transcription factor ZmWRKY17, dhn_ESK2 등이 발현하였으며, 양성구화의 시작단계에서는 에틸렌(ethylene)을 조절하는 PtLTP1, 옥신(Auxin)을 수송하는 PIN1, 질소를 수송하는 NPF7.3을 동정하였다. 그리고 암구화에서는 조직에 상시 특이적으로 발현하는 지베렐린과 브라시노스테로이드 생합성에 관여하는 CYPs, gibberellin metabolism genes 등 호르몬의 전구체들이 주로 동정되었다. 특히, 측면부에서 발달하는 암구화에서는 LINE-1 retrotransposable element를 동정하였다. 당년지 정단에서만 구과가 발달하는 집단(AC, apical cone)과 정단 및 측면에서 구과가 발달하는 집단(SC, side cone)의 비교 분석 결과 16,666개의 SNP가 두 집단간에 차이가 있음을 발견하였으며, 그 중 집단 내에서 모두 일치하지만 집단간에 차이가 나는 homo/homo SNPs 92개를 선별하였다. 선별한 SNPs 위치의 reference genome의 서열과 RNA-seq 데이터에 mapping한 결과 Pinus pinaster의 transposon PpRT1을 발견할 수 있었다. 선발한 SNP에 대한 위치의 서열이 어떤 기능을 하고 있는지는 아직 추가 연구를 통하여 밝여나가야 할 것이다. 본 연구결과를 통하여 당년지 측면에서도 정단과 동일한 암구화가 발달한다는 것을 발견할 수 있었으며 반송의 화기 구조에 따라 발현하는 것으로 추정하는 유전자들을 선별할 수 있었다. 또한 암구화의 발생 위치에 따른 유전적 차이를 발견 할 수 있었다. 향후 본 연구에서 발견한 유전자들의 기능 연구와 SNPs 분자표지 분석 결과에 따른 표지 개발 등 후속 연구가 필요할 것이다.