DNA Methylation Changes as an Exposure Signature of Cigarette Smoking

Abstract

흡연은 폐/심혈관계 질환 및 폐암 등 여러 질환들에 대한 교정 가능한 (modifiable) 위험 요인 임에도 불구하고, 흡연의 기여 사망률은 전세계적으로 11.5 % 에 달한다. 이러한 흡연 관련 건강영향을 평가하기 위해서는 정확한 흡연 노출 및 노출량 측정이 선행되어야 한다. 흡연 노출 평가에 이용되는 대표적인 방법에는 자가 보고 (self-report) 기반 설문 도구와 더불어, 코티닌 (cotinine) 과 같은 체내의 흡연 관련 대사체의 농도를 측정하는 등 생체 지표 (biomarker) 들을 이용하는 방법이 있으나, 최근 흡연 노출만을 제한적으로 반영한다는 한계점을 가진다. 이에 따라, 현재 뿐만 아니라 과거 흡연 노출을 반영하는 지속성 및 안정성을 보이는 지표들을 발굴하기 위하여 흡연 관련 후성유전 연구가 활발히 진행되고 있다. 후성유전 (Epigenetics) 은 DNA 염기서열 상의 변화 없이 유전자의 발현에 영향을 주는 유전적 현상을 가리키며, DNA 메틸화 (DNA methylation) 는 유전적인 요인 뿐만 아니라 생애 전반에 걸쳐 노출되는 여러가지 환경적인 요인들에 의해서 결정되는 대표적인 후성유전학적 지표이다. DNA 메틸화는 가변적인 특성 때문에 특정한 환경적 요인에 의한 특이적인 DNA 메틸화 변화를 발굴하기 위해서는 여러 가지 잠재 교란 요인들이 통제되어야 한다. 이에 따라, 본 연구는 유전 및 환경적 요인에 의한 교호 작용을 통제할 수 있는 일란성 쌍둥이 및 그 직계 가족들의 샘플을 이용하여 흡연 노출에 대해 특이적으로 변화하는 DNA 메틸화 지표를 발굴하고자 수행되었다. 먼저, 전장 후성유전체 연관 분석을 통해 흡연 여부에 따른 쌍둥이 간의 DNA 메틸화 차이를 관찰하는 분석을 수행하였다. 나아가, DNA 메틸화 수준의 변화와 연관된 단일염기성다형성 (Single nucleotide polymorphisms, SNP) 변이를 찾는 mQTL (methylation quantitative loci) 분석을 수행하였다. 최종적으로, 연관 분석에서 발굴된 흡연 관련 DNA 메틸화 지표들을 바탕으로 검증 데이터 (validation set) 의 각 샘플들에 대하여 DNA 메틸화 점수를 부여하여, DNA 메틸화 기반 점수의 흡연 예측 능력을 평가하였다. DNA 메틸화 분석을 위해 한국인 가족-쌍둥이 (KHT) 코호트 및 호주의 Australian Mammographic Density Twins and Sisters Study (AMDTSS) 코호트로 부터 각각 534명 및 132명의 대상자들이 포함되었다. KHT 코호트와 AMDTSS 코호트에서 각각 156쌍, 66 쌍의 일란성 쌍둥이 대상자들이 분석에 포함되었다. 말초 혈액 백혈구 샘플에서 DNA 를 추출한 다음, KHT 의 385 명의 대상자 및 AMDTSS 의 모든 대상자들의 샘플은 Illumina 사의 Infinium HumanMethylation 450 BeadChip 로 어세이하여 유전체 내 약 450,000 개 이상의 DNA 메틸화 위치에 대한 DNA 메틸화 수준의 데이터를 얻었으며, 총 149 명의 KHT 코호트의 샘플들은 Illumina 사의 Infinium MethylationEPIC BeadChip 로 어세이하여 유전체 내 총 850,000개 이상의 위치에 대한 DNA 메틸화 정도를 측정하였다. R 소프트웨어의 생물정보학 관련 패키지들을 이용하여 기존 대규모 메타 연구에서 밝혀진 18,000 개 가량의 흡연 관련 DNA 메틸화 지표에 대해 일란성 쌍둥이 내의 DNA 메틸화의 차이를 평가하고, 나아가 KHT 및 AMDTSS 코호트의 결과로 메타 분석을 수행하였다. 또한, 약 18,000 개의 각 DNA 메틸화 지표에 대해서 ±1Mb 위치 내의 SNP 과의 연관성을 검정하는 mQTL 분석을 수행하였다. 나아가, DNA 메틸화 점수는 크게 다음과 같이 총 3가지 모형에 대한 흡연 예측 능력을 평가 및 비교하였다. (1) 유의 수준 5X10-5 미만의 흡연과의 연관성을 보인 DNA 메틸화 지표들로 구성된 세트, (2) 유의 수준 0.05 미만의 DNA 메틸화 지표 중 mQTL의 영향을 받는 지표들을 제거한 나머지 지표들로 구성된 세트 및 (3) mQTL의 영향을 고려하지 않은 세트에 대해 DNA 메틸화 점수를 계산하여 흡연 여부에 대한 예측력을 평가하였다. 후성유전체 연관 메타 분석에 따르면, AHRR (cg23576855), ALPPL2 (cg21566642, cg01940273, cg05951221), MYO1G (cg12803068) 와 F2RL3 (cg03636183) 등의 유전자좌 내의 CpG 위치에서 DNA 메틸화 수준의 차이가 관찰되었다. mQTL 분석에서는 기존 연구에서 밝혀진 흡연 관련 DNA 메틸화 지표 중 약 19.6%가 적어도 하나의 근위 단일염기성다형성과 연관이 있는 것으로 확인되었다. 상위 연관 지표들로 계산되 DNA 메틸화 점수는 흡연 여부에 대한 예측력 (AUC) 은 검증 데이터 세트에 따라 약 0.84~0.92으로 계산되었다. 유의 수준 0.05 미만의 지표 중 mQTL 의 영향을 받는 DNA 메틸화 지표들을 제거한 세트의 AUC는 0.65~0.78, mQTL 과의 연관성을 고려하지 않은 세트의 AUC 는 0.61~0.75 에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 높았다. 본 연구는 일란성 쌍둥이 및 가족 연구를 바탕으로 기존에 알려진 흡연 관련 후정유전학 지표들 중에 유전적 변이를 받는 지표들과 흡연 노출을 특이적으로 반영하는 지표들을 구분하고, 각 지표들의 흡연에 대한 예측 성능을 비교하였다. 나아가, 흡연 관련 DNA 메틸화 지표는 정확하게 흡연 노출력을 평가하고, 흡연 관련 건강 영향 평가에 활용될 것으로 기대된다.

Introduction: Mounting evidence suggests that both genetics and environments shape DNA methylation (DNAm) status throughout lifetime. Little is known about reproducible DNAm changes that are specifically induced by environmental exposure. This study aimed to identify exposure-specific DNAm changes, particularly due to smoking. We first investigated smoking-associated DNAm changes in monozygotic (MZ) twins. CpG sites (CpGs) associated with smoking were subsequently examined for possible genetic control by methylation quantitative loci (mQTL). Finally, we evaluated DNAm score using smoking-associated CpGs for prediction of smoking. Methods: We obtained peripheral blood DNAm data of 385 samples (95 pairs of MZ twins for the discovery set and 195 non-MZ twin first-degree relatives for the validation set) from the Korean Healthy Twin (KHT) using Illuminas HumanMethylation450 array. An additional validation set of 149 samples (61 pairs of MZ twins and their first degree relatives) from the KHT were analyzed using Illuminas Infinium MethylationEPIC BeadChip array. We also obtained peripheral blood DNAm data of 479 individuals (66 pairs of MZ twins for the discovery set and 347 non-MZ twins for the validation set) from the Australian Mammographic Density Twins and Sisters Study (AMDTSS), using Illuminas Infinium HumanMethylation450 array. We tested associations between smoking and DNAm changes across >18,000 CpGs that were previously reported to be associated with smoking. After assessing study-specific smoking-associated CpGs, we meta-analyzed the two studies. To identify genetic control over DNAm, we performed methylation quantitative loci (mQTLs) analyses using the KHT genotype data of a total of 289 individuals, followed by subsequent examinations of whether those mQTLs are associated with smoking. Finally, we computed weighted DNAm score to assess its performance for prediction of smoking. Results: In the KHT MZ twins, 8 CpGs were significantly associated with high-dose smoking exposure (≥10 pack-years) at the suggestive significance threshold of p<5e-5, including CpGs in AHRR, 2q37.1 (in the vicinity of ALPPL2), MYO1G and IL. In the analysis of the AMDTSS MZ twins, 5 CpGs (annotated to 2q37.1, VARS and AHRR) were significantly associated. In the meta-analaysis, 14 CpGs in AHRR, 2q37.1, MYO1G and F2RL3 were significantly associated with ≥10 pack-years of smoking. In the mQTL analysis, 3,609 (19.7%) of the previously reported >18,000 smoking-related CpGs were significantly associated with at least one proximal SNP (cis-mQTL) at Bonferroni-corrected p<0.05. 185 (22.1%) out of the smoking-associated 838 CpGs (meta-analysis of associations p<0.05) were associated with cis-mQTLs (Bonferrnoi-corrected p<0.05). None of the significant mQTLs were associated with smoking. DNAm score based on smoking-associated CpGs (p<5e-5) was computed for prediction of smoking, yielding an AUC of 0.917, 0.895 and 0.84 for the KHT I and II and the AMDTSS validation sets, respectively. With the exclusion of mQTL-associated CpGs (association p<0.05 with smoking), AUC has significantly improved (0.745 to 0.777, 0.7 to 0.734 and 0.61 to 0.646 for the KHT I and II and the AMDTSS validation sets, respectively). Discussion: We found epigenetic signatures of smoking across multiple loci including AHRR, 2q37.1, MYO1G and F2RL3. ~20% of the previously reported smoking-associated CpGs were under significant genetic control. DNAm score using the most significant CpGs was informative of predicting high-dose ever-smoking status. CpGs that are independent of effects of mQTLs showed superior performance in predicting smoking. A set of DNAm-associated markers may serve as a stable biomarker of exposure to smoking.